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突变范文10篇

时间：2023-03-30 14:36:07

突变范文篇1

【关键词】体细胞突变;非癌组织;食管;结直肠;肝脏

突变是指生物体、病毒基因组核苷酸序列的改变。造成突变的可能原因包括染色体重组、DNA错误复制、DNA修复机制缺陷、诱变剂暴露、病毒感染等。突变通过核苷酸替换、片段插入或缺失、染色体重排和拷贝数变化等方式，在一级结构上改变DNA序列，进而导致编码蛋白量和质的变化［1］。一方面，突变是自然选择的最初来源，是生物进化的动力;另一方面，经典理论认为，关键癌基因、抑癌基因或其调控序列上发生的突变则是导致肿瘤发生的重要原因:突变将赋予早期肿瘤细胞克隆扩增优势，以及不受控制的生长、组织侵袭破坏、血管生成和逃避凋亡等能力。上述机制不断驱动基因在肿瘤细胞中正向选择，并造成肿瘤细胞克隆扩增，最终形成肿瘤演进过程中的正反馈，促进肿瘤形成和发展［2-3］。然而，在形态正常的细胞中，突变是如何选择与累积的，细胞的生物学行为又是如何受其影响的，人们在这方面的认识尚较为有限。

1发现非癌组织细胞突变的测序技术

从测序通量与准确性上来说，一代测序(Sanger测序法)虽是鉴定DNA序列改变的“金标准”，但其通量低、操作繁琐费时的弊端限制了人们对突变基因集的整体认识［4］。如今，以Illumina等公司为代表的二代测序技术利用桥式扩增及多片段拼接原理，则可对DNA进行高通量突变检测，比如全基因组测序(wholegenomesequencing，WGS)及全外显子测序技术(wholeexomesequencing，WES)。在二代测序平台上，WGS可对生物体整个基因组序列进行测序，以获得完整的基因组信息;WES可以检测基因组上编码区的突变情况，能够发现直接影响蛋白质氨基酸序列的遗传变异，目标性更强，测序成本也相对低廉，测序后数据的分析也相对简单［5］。对于非癌组织细胞来说，突变往往仅存在于分散且数量有限的克隆之中［6］，因此，识别非恶性组织中的体细胞突变，需要通过足够深度的测序才有可能得以实现［7-8］。近年来，随着高通量深度测序技术的发展，人们在非癌组织中发现了越来越多的突变累积，比例甚至高达37%。也就是说，在100个非癌形态和/或非癌生物学行为的“正常”细胞中，有近40%带有不同程度的基因突变［9-10］。这些带有突变的细胞群以小克隆的形式存在，在组织发育及细胞命运决定方面发挥着未被认识的新功能。目前，已在食管［11-13］、结直肠［14-16］、肝脏［17-19］、皮肤［20］、支气管［21］、子宫内膜［22-23］、尿路上皮［24-25］、血液［26-28］等多种类型的非癌组织中发现有体细胞突变的存在。其中，食管、结直肠上皮黏膜及肝脏是人体更新最为活跃的部位之一，此处的非癌组织突变易于产生“放大效应”，因此，本文主要就前三种消化系统器官组织的非癌细胞突变作一概述。

2非癌组织细胞突变的发现及其意义

借助超深度的测序技术，人们得以在非癌组织中探究体细胞突变情况。在某些情况下，部分发生突变的基因呈现聚类趋势，称为突变特征(mutationalsigna-ture，MS)。目前，人们已发现一百多种不同的MS，包括由紫外线照射或吸烟等外部因素引起的MS、由DNA修复机制缺陷等内在因素引起的MS两大类。MS的发现揭示了癌症发生中突变过程的多样性，对理解癌症的病因、提出新的治疗和预防措施均具有重要意义［1，29-31］。

2．1食管

食管是人体中最容易接触外源物质的器官之一，食管上皮细胞直接接触多种外源性刺激物，大大增加了突变的发生概率。Martincorena等［11］对9名20～75岁的志愿者的食管上皮样本进行了平均覆盖率为37×的全基因组测序以及74个癌基因的超深度(870×)靶向测序，鉴定出了8919个体细胞编码突变，并发现突变数量及突变克隆的大小随着志愿者年龄的增长而增加，为突变累积学说提供了确切证据。对突变基因的分析结果显示:在角质形成细胞分化中起关键作用的信号通路相关分子(NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、TP63、AJUBA)、细胞氧化应激相关分子(NFE2L2、TP53)、细胞周期蛋白(CCND1)、蛋白质修饰分子(PIK3CA、CUL3)、表观调控分子(KMT2D)均存在不同程度的突变累积，其中至少有11个基因与食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscarcinoma，ESCC)的发生密切相关。有趣的是，该研究还发现NOTCH1在食管非癌细胞中的突变频率远超癌变细胞。除NOTCH1基因外，Yokoyama等［13］在不同年龄、不同生活方式的139例ESCC患者中发现，非癌组织的PPM1D、NOTCH2、ZFP36L2、FAT1、NOTCH3、CHEK2和PAX9的突变频率均显著高于ESCC。这些以往被归为促癌基因的分子在非癌组织中的突变累积更高，提示这些癌基因仍为野生型的食管上皮更易发生肿瘤，刷新了人们的认识。此外，研究者在非癌食管组织的样本中总结了与重度吸烟、酗酒等生活方式相关的MS，并发现了与载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽家族(apolioproteinBmRNA-editingenzymecatalyticpolypeptide，APOBEC)等酶活性相关的MS，提示对于已出现酶活性MS的潜在ESCC患者来说，改善生活习惯可能为其带来更大的获益［32］。衰老通过累积突变使组织细胞获得多克隆性，是肿瘤发生的重要机制之一［33-34］。上述研究均发现衰老食管上皮中累积的突变与肿瘤中存在的突变存在部分重合，这提示ESCC发生后，细胞获得突变的速率及频率大大增加，可能是肿瘤演进的关键原因。进一步了解非癌食管组织中的突变情况，借此筛选出癌组织中的独有突变，这有助于发现并鉴定更多的癌基因，从而为肿瘤早期诊断和靶向治疗提供重要指导。

2．2结直肠

结直肠癌在全球发病率排名第三，死亡率排名第二［35］。不良的生活行为如高脂饮食、长期吸烟及酗酒均是结直肠癌发生的高危因素［36-37］。肠壁中广泛分布的三级淋巴器官、肠腔中高丰富度的肠菌生态与外源物质、肠道上皮黏膜高度活跃的更新周期，这些特点使结直肠更易于受到急慢性炎症攻击。Lee-Six等［14］利用显微切割及WES技术，在11～78岁志愿者的2035个非癌结肠隐窝中发现了可能驱动肿瘤发生的突变集，其中包括抑癌基因如AXIN2、STAG2及具有典型错义突变的癌症基因如PIK3CA、ERBB2、ERBB3、FBXW7等。研究者进一步发现，正常结直肠上皮、腺瘤、结直肠癌细胞中基因突变的相对频率也各不相同，例如:结直肠癌中APC、KRAS、TP53的突变非常普遍，但在非癌隐窝中非常稀少;而ERBB2、ERBB3等驱动突变在非癌隐窝中普遍存在，但在结直肠癌细胞中则较为少见。就这一点来说，结直肠上皮非癌性细胞与癌性细胞的突变模式是与以往认识相吻合的。溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)是结直肠癌发生的高危因素。与健康个体相比，UC患者结肠上皮细胞处于慢性炎症微环境中，较多的炎症因子及自由基分子使得细胞可能出现较高频率的基因突变［38］。Kakiuchi等［15］对健康人及UC患者的肠道隐窝分别进行全外显子测序，发现UC患者中存在多克隆性的隐窝重塑。在这些由NFKBIZ、TRAF3IP2、ZC3H12A、PIGR、HNRNPF等基因突变而被正向选择的克隆中，上皮间质细胞中IL-17和其他促炎信号均处于明显下调状态，提示上述正常隐窝中的基因突变兼有降低免疫反应的功能。一方面可能是慢性炎症过程中的适应性改变，对机体有益;但另一方面，带有突变的克隆间质处于免疫抑制状态，也可能为肿瘤发生过程中的免疫逃逸现象提供了分子基础。在长期慢性炎症状态下，血液中的PBMC也可能存在突变［26-27］。为排除这种因素的干扰，Nanki等［16］在除去免疫细胞中可能存在的突变后，利用人结直肠类器官模型及WES，进一步验证了NFKBIZ、ZC3H12A和PIGR在UC患者中处于突变状态。但UC患者肠上皮细胞中普遍存在的NFKBIZ突变却较少出现在UC相关性结直肠癌中，这提示结直肠癌发生过程中存在针对NFKBIZ突变细胞的负向选择机制，NFKBIZ突变不利于结直肠癌发生。这个推测在NobuyukiKakiuchi的NFKBIZKO突变小鼠模型中得以验证:研究人员发现带有该突变的小鼠在诱变剂的处理下，结直肠肿瘤发生比例也显著降低，这可能与NFKBIZ突变不利于结直肠上皮细胞生存有关［16］。上述研究不仅描述了结直肠癌发生过程中隐窝携带驱动突变，并在肿瘤演进过程中逐渐建立选择优势的路径;也同时展示了结直肠癌突变克隆的范围、驱动突变频率等演进动力学指标，有助于深化人们对肿瘤发生发展过程的理解。

2．3肝脏

肝脏是人体重要代谢器官，大多数的药物及毒物均在肝脏中进行分解代谢，而部分代谢产物具有比原形更活跃的促突变能力，这一特点使肝脏更易暴露于促突变物质中。另一方面，肝脏是一个易于受到炎症、缺血缺氧等内部因素打击的器官。同时，肝炎病毒、酗酒等因素是导致肝脏慢性损伤的重要原因［39-41］，也是突变产生的重要因素。这些特点使肝癌的发生率占据所有恶性肿瘤的第五位［35］。为揭示肝癌发生的遗传学基础，Kim等［18］研究了肝癌高危病变—肝硬化中再生结节(regenerativenodule，RN)组分细胞的突变情况。对205个肝硬化RN进行了30个肿瘤相关基因的深度靶向测序，在其中47个RN中检测到阳性结果:HCV相关RN中含有ARID1A、ARID2和TP53的体细胞突变;HBV相关RN中发现了NCOR1、TSC1和CDKN1A的体细胞突变;提示病毒感染相关的RN可以获得具有癌症相关基因突变的细胞亚群，为研究肝炎－癌转化的机制提供了分子基础。令人意外的是，这205个RN中均未检测到端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)启动子突变，提示TERT激活可能是肝硬化RN发展为肝细胞癌的关键因素。除此之外，Brunner等［17］通过对482个正常肝组织和肝硬化组织的显微切割样本进行70×WGS，发现在正常肝细胞存在1%～5%的突变驱动克隆;在正常肝组织和肝硬化样本的突变数据中，均包含抑癌基因ACVR2A、ARID2、ARID1A、TSC2等基因的失活突变，但肿瘤中的差异突变则只剩下ACVR2A，并带有较多ALB突变。ALB编码白蛋白，在正常肝组织中具有较高的转录频率，在该项研究中由于插入缺失突变而失活。这似乎提示插入缺失突变可能优先发生在多次转录的模板基因中。高转录活性的基因为何易于发生插入缺失突变，这同样是一个值得深入探究的科学问题。有意思的是，Zhu等［19］通过CRISPR技术建立小鼠基因突变模型，对测序结果突变频率较高的PKD1、KMT2D、ARID1A等基因进行了体内水平的验证，发现这些突变在一定程度上能促进肝组织再生。这提示并不是所有的突变均只是单方面的有害突变，有些还可能有助于增加肝细胞的适度再生，有益于肝脏功能。肝脏具有的MS集合有助于解释其从慢性肝病到肝癌的复杂转变过程。慢性肝病组织比正常肝脏脂质存在更多高度动态变化的克隆，这些克隆被纤维化带所隔离，具有显著区域性特征。值得注意的是，肝脏非癌组织带有的部分突变既可能促进肝组织再生，也可具有促进肿瘤的潜能。这些突变如何在损伤修复－肿瘤发生过程中“博弈”?其综合效应为何?可能更大程度上依赖于突变特征以及克隆规模，尚有待于进一步研究。

3展望

突变范文篇2

利用安全流变—突变理论开展心理学研究的可行性

(一)心理学的发展史是一部吸收融合新理论的发展史哲学是心理学的母体，哲学为心理学提供理论框架和指导思想，但哲学不能为心理学提供实证基础。心理学摆脱哲学的附庸地位在于逐步采用了自然科学的观察法和实验法，最终逐步剥离哲学，正式成为一门独立的科学。心理学究竟是自然科学还是人文科学，亦或是自然科学和人文科学的交叉学科，从心理学正式成为一门科学开始，就争论不休，各执一词，直至目前心理学界也未达成共识。“确定地说，心理学是一门介乎自然科学与社会科学之间的中间科学、边缘科学、交叉科学。”［7］可以说，心理学的发展史是一部不断融合最新理论、汲取其他学科营养(包括自然科学和人文科学等学科)来充实自身发展并不断创新的历史。回顾心理学的发展历程，可以看出，各种新式理论均与心理学有渊源。新式理论应用于心理学，既扩大了新式理论的应用范围，同时也促进了心理学的发展。理论借鉴虽有瑕疵，仍不失为一项不错的尝试。如勒温的场论就借鉴了物理学中“场”的相关概念，费希纳对物理刺激和它引起的感觉进行数量化研究创建心理物理学，认知心理学就应用了控制论、信息论、计算机科学的相关理论。近年来不断有研究者将混沌学、非线性科学的相关理论应用到心理学的研究，从不同侧面诠释心理学内容，也取得了不错的效果［8－9］。(二)心理问题属于广义上的安全问题辩证唯物主义认为，事物是不断运动变化的，对立统一规律是物质世界运动、变化和发展的最根本的规律。在自然界和人类社会中，也始终存在着安全与危险这一对矛盾。“人类创造精神和物质财富的一切活动都在安全与危险的矛盾之中进行。自然资源的开采和利用带来了自然环境的变化和破坏;机电设备的广泛应用带来了各种机电事故;人在越来越复杂的环境中活动，其自身的承受能力和心理状态都会发生较显著的变化。当这些变化超出一定的阈限后，人的安全状态便进入危险状态。因此，各学科领域都存在安全科学的内容。”［3］心理问题是由于个人及外界因素引起个体强烈的心理反应(思维、情感、动作行为、意志)并伴有明显的躯体不适感，是大脑功能失调的外在表现。当心理变化达到人的承受能力极限时便进入危险状态。广义上讲，心理问题也是安全问题。可以这么认为，心理安全属于大安全理论范畴的一个分支，心理问题在某种意义上可以纳入安全科学的研究范畴。基本依据如下。从定义上看，安全科学是研究事物发展过程的安全演化规律的科学。心理学是研究心理现象发生、发展和活动规律的科学。心理的变化发展过程是事物发展的基本过程。从状态概念上看，安全科学的状态有安全、危险、事故等3个状态，而心理状态粗略讲有健康、亚健康、病态等3个状态。二者在形式和内容上都存在某种对应关系。从基本观点上看，安全科学认为事物的安全状态处于不断的变化之中，安全是相对的，不安全是绝对的;事物安全状态的变化符合量变到质变的原理。心理学同样认为人的心理处于变化之中，健康是相对的，不健康是绝对的;心理状态也符合量变到质变的原理。(三)利用安全流变—突变理论阐释心理变化过程的可行性安全流变—突变规律是事物安全演化的基本规律和本质规律，其哲学思想和方法能揭示安全科学的普遍性概念和规律，为安全科学研究提供方法论指导。“自然科学方法在社会科学领域中的应用既有必要，也有可能。”［10］安全科学的流变—突变理论是利用自然科学研究方法得出的结论，亦可适用于心理问题研究。有一种立场就主张心理学应该以现代自然科学的世界观和方法论为基础，注意现代自然科学对心理学的意义。同时，辩证唯物主义认为，客观世界是一个相互联系、不可分割的整体，世界具体有整体性和统一性。同时，心理学的发展史也已经表明，自然科学的相关理论早已被移植到心理学研究当中，并有力地推动心理学不断向前发展。从以上分析可以看出，利用安全科学已有的规律和理论来分析和阐释心理问题是恰当的，也是可能的。

安全流变—突变理论对心理学的启示

(一)心理变化过程的新诠释人的心理过程是动态的变化发展过程，随着主观意愿和客观环境的变化而变化。心理变化过程一般都要经历发生、发展、消亡等几大阶段。按照安全流变—突变理论，个体心理变化过程一般遵循OAF-BCD曲线(如图2所示)。当心理问题出现时就需要及时辅导或者干预，以便最大程度上减轻心理疾病带来的困扰。下面仅以实施个体心理干预为例进行解释。图2实施干预的心理问题流变—突变示意图在实施干预前，心理变化过程的各阶段分别为:OA—孕育阶段;AB—发生阶段;BC—发展阶段;CD—结束阶段;DE—后效阶段。当实施第一次心理干预后，各阶段变为:OA—孕育阶段;AFGHK—发生阶段(又分为AF、FG、GH、HK四个阶段)。当实施第二次心理干预后，变化情况类似于第一次，变成曲线KLMNQ。当心理干预在F点作用后，原有的心理变化过程由OAFBCD变为OAFGHKIJ。经过干预后，心理损伤流变—突变过程发生了改变。FG段为心理损伤减速降低阶段，个体心理状况好转。到达G点时，心理变化趋于平稳。进入GH段，即心理稳定发展阶段。HI为心理损伤加速增加阶段，I点为心理突变的预警点，此时如果不继续采取措施，个体将进入IJ段，J为突变点，超过J点个体进入突变阶段。以此类推，若个体干预发生在K点，流变—突变曲线将由OAFGHKIJ变成OAFGHKLMNQ。到达L点时，心理变化趋于平稳。进入LM段，即心理稳定发展阶段。MQ为心理损伤加速增加阶段，N点为心理突变的预警点，此时如果不继续采取措施，个体将进入NQ阶段，N为予警点，Q为突变点，超过Q点个体进入突变阶段。当然，个体有自我修复能力，在没有外界干预情况下，很多时候依然能自我修复。但依然可以用图2进行解释。如心理变化达到F点时，个体开始自我修复，依然会将曲线从OAFBCD变为OAFGHKIJ。(二)心理辅导或干预需要把握关键节点从图2可以看出，对心理进行辅导或干预在不同的阶段进行会产生不同的结果。若每一次后续干预都在系统流变阶段的话(如在AB段的F点，GHI段的K点)，每一次都能延长个体安全流变的时限。所以，心理干预应该是持续的，不断进行的，并不能期望依靠最开始的一次干预就能解决问题。后续干预的起始点是有选择的，应该选择在损伤量加速增加阶段，最晚不能迟于预警点。只有这样，才能使个体心理流变阶段能够尽量延长，从而最大限度的发挥心理干预的作用。安全流变—突变理论作为普适性理论，对自然科学和社会科学研究都有方法论意义。用安全流变—突变理论的角度来分析心理变化过程，能在对心理问题进行干预时的整体把握的基础上进行相对严格的过程控制，为心理干预提供了指导。作为主观的人的复杂性，决定了单单依靠某一个理论是难以准确、完整描述心理变化过程的。安全科学是一门新兴科学，其自身也还在不断发展、完善。利用安全流变—突变规律来诠释心理发展变化过程还只是一种初步的探索，有些论述还不是很完善和充分。将安全理论的概念和方法引入心理学研究不失为一种新的尝试，还有待深入研究。

本文作者：朱正中工作单位：中国矿业大学

突变范文篇3

在遇到这类问题时，最重要是不要慌，同时切勿急躁，回答要有条理。

第一，面对领导突发的错误和问题，如何应急突变。

例如：你给领导起草一个讲话稿，领导正在发言，你发现发言稿上的数据有误，可是在底下还要重复多次的提到这个数据，会议已经开始了，你该怎么办？

参考解答：尊敬的考官，您假设的这种情况在我今后的工作中是不会出现的，因为我作风严谨，对工作一丝不茗，认真细致。假如出现这种情况的话，我会镇定情绪，快速作出补救有效措施，会按以上步骤进行补救：（1）我会按具体问题具体分析的原则，假如是在我单位举办的话，我如果有条件到主席台上去的话，借倒水时写一更正后的小纸条传递给领导。假如不在我单位召开的话，我会写一更正后小纸条快速找到会议组的工作人员将其传递给领导。（2）会后写出检查，交付领导审阅，同时总结经验，吸取教训，下不为例。

第二、面对失控局面和突发事件，如何应急突变。

例如：有相邻两村分别属于乡镇，两村各有200人在为地打架，假如你是其中一个乡的乡长，遇到这样的情况，你会怎么办？

参考解答：（1）我会稳定情绪，控制局面。迅速和本乡派出所干部联系，并迅速到事发地控制事态发展。（2）在去的过程中，给村干部打电话让他们往现场赶制止自己的村民。（3）给相临的村的乡长打电话以商量的口气，让他前往。（4）给自己所辖村民说明利弊，顾全大局并选出一名代表到乡来说明情况，找出事情的症结并记录。同时与相关乡选出的代表共同查找原因，使其意见趋向一致，达成协议，来控制事态的发展。（5）在今后的工作中，坚决杜绝和避免上访事件，不给上级填麻烦，要加强对自己所辖区域百姓教育和法律宣传，坚决杜绝此类事件再次发生。

第三、面对自己突遭的诬陷和困境，如何应对

例如：假如一天你在大街上走着，突然过来一人，在你口袋里放入一个钱包，随即又掏出来大喝一声：“干吗偷我的钱包”请问你遇到这样的情况你会怎么办？

参考解答：首先我会稳定自己的情绪再稳定对方的情绪，尽量不和对方正面冲突避免流血事件和伤亡事件，我会快速的理清思路，沉着机智，语气和缓，言辞委婉的诱使对方跟随我到就近的派出所；其次，我会将今天发生的事向亲友广为宣传，让大家注意，让这样的人再无藏身之处。

又例如：考官问题：经过这次面试，我们认为你并不适合做公务员，决定不录用你，你自己认为有哪些原因？

参考解答：我认为要获得面试的成功，主要靠实力，但也有运气的成分在里面。我们不能指望凭一次面试就能对一个人的才能、品格有充分的了解和认识。

通过这次面试，我学到了很多东西，也发现了自己的不足——既有临场经验的不足，也有知识储备的不足。希望今后能有机会向各位考官讨教。

突变范文篇4

1资料与方法

1．1一般资料

选取我院2009—2010年食管鳞状细胞癌患者36例，男25例，女11例；年龄39-75岁，中位年龄59岁；其中有淋巴结转移21例。

1．2方法

1．2．1提取DNA：取手术切除标本，取组织蜡块切片10片，厚度为1O一20m，放入试管中，用酚氯仿法提取DNA。试剂由达柯公司提供。

1．2．2PCR．SSCP：正常对照采用人外周血白细胞DNA；P53基因第5、6、7和8外显子，片段长度分别为21lbp、185bp、139bp、200bp。PCR反应条件：94℃保温lmin、55℃40s、72℃30s共32个循环后72℃延伸5min，反应完成后，取5l产物行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。然后取1OPCR产物加等量变性上样指示剂，沸水中变性8min，立即冰浴5min，取6上样于8％非变性聚丙烯酰胺凝胶行垂直电泳。

1．3统计学方法

计数资料以率(％)表示，组间比较采用检验，P<0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1P53基因的突变与人外周血白细胞DNA谱带对照，突变的标本显示异常泳动带，表现在增多、减少或变位。在36例食管鳞状细胞癌组织中出现P53基因突变l4例，突变率为38．89％，其中第5外显子4例、第6外显子3例、第7外显子2例、第8外显子5例。作者单位：450052郑州市，郑州大学第五附属医院病理科

2．2肿瘤分化程度与P53基因突变的关系依据常规病理，将食管鳞状细胞癌的分化程度分为高分化、中分化、低分化癌。36例食管鳞状细胞癌患者中，高分化癌9例，P53基因突变2例(22．22％)；中分化癌l6例，P53基因突变5例(31．25％)；低分化癌11例，P53基因突变7例(6364％)。低分化癌的P53基因突变率明显高于中分化、高分化癌的突变率(P<0．05)。

2．3淋巴结转移与P53基因突变的关系36例食管鳞状细胞癌患者中，有淋巴结转移者2l例，P53基因突变l2例(57．14)％；无淋巴结转移者15例，P53基因突变2例(13．33％)。有淋巴结转移者P53基因突变率高于无淋巴结转移者突变率(P<0．05)。

突变范文篇5

摘要：目前临床应用的抗病毒药物达40多种，为病毒引起的疾病的治疗发挥了重大作用。与临床其他抗感染药物一样，抗病毒药物长期应用易产生耐药性，降低疗效，成为临床治疗及新药开发的重要问题。本文就抗艾滋病毒药物、抗乙型肝炎病毒药物、抗流感病毒药物及抗疱疹病毒药物耐药性及耐药机制研究进行综述。

关键词：抗病毒药；耐药性；耐药机制

Advancesinantiviraldrugresistanceandresistancemechanisms

ABSTRACTTherearemorethan40antivirusdrugsintheclinicaluse,whichhaveplayedveryimportantroleinthetreatmentofviraldiseases.Likeotherkindofantiinfectiondrugs,antivirusdrugscanalsoinduceresistanceinlongtimeusethatresultsthereducingoftherapeuticefficacyandbecomingaverytoughproblemintheclinicaltreatmentandthedevelopmentofnewdrugs.ThispaperbrieflyreviewedtherecentadvancesinresistanceandresistancemechanismsofantiHIVdrugs,antiHBVdrugs,antiinfluenzadrugsandantiHSVdrugs.

KEYWORDSAntivirusdrugs;Resistance;Resistancemechanisms

病毒性传染病居传染病之首(占60%以上)，发病率高、传播快，对人类健康形成莫大的威胁。如艾滋病(AIDS)、重症急性呼吸系统综合征(SARS)，各种病毒性肝炎、流行性出血热、流感、感冒、婴幼儿病毒性肺炎、成人腹泻、病毒性心肌炎等等。近20年来，尤其是20世纪90年代，抗病毒药物发展突飞猛进，目前在临床应用的抗病毒药物达40多种［1］，为治疗病毒引起的感染发挥了重大作用。与临床其他抗感染药物一样，抗病毒药物长期应用易产生耐药性，降低疗效，病情复发，成为临床治疗及新药开发的重要问题。本文就各类临床应用抗病毒药物耐药性及耐药机制研究进展介绍如下。

1抗艾滋病药

1.1抗艾滋病药的作用靶点［2］艾滋病毒(HIV)复制过程中有三个由病毒基因编码的复制关键酶，即逆转录酶(reversetranscriptase,RT)、蛋白酶(protease,PR)及整合酶(integrase)，它们均为发展抗艾滋病毒药物的重要靶点。目前上市抗HIV品种有21个，针对前两个酶的抗艾滋病毒药物可分为核苷类逆转录酶抑制剂，非核苷类逆转录酶抑制剂及蛋白酶抑制剂三类。第四类为HIV入胞抑制药。

1.2核苷类逆转录酶抑制剂(nucleosidereversetranscriptaseinhibitor,NRTI)耐药性及耐药机制属于NRTI的抗艾滋病毒药物共有8个品种，即齐多夫定(zidovudine，AZT)、去羟肌苷(didanosine，ddI)、扎西他滨(zalcitabine，ddC)、司他夫定(stavudine，d4T)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、阿巴卡韦(abacavir，ABC)、富马酸替诺福韦酯(tenofovirDF，TDF)、恩曲他滨(emtricitabine,FTC)。NRTIs均为DNA合成天然底物的衍生物，AZT及d4T为脱氧胸苷的类似物，ddC、3TC及FTC为脱氧胞苷的类似物，ddI及tenofovirDF为脱氧腺苷及开环脱氧腺苷酸的类似物，ABC为脱氧鸟苷的类似物，它们均需在细胞内转化为活性三磷酸或二磷酸衍生物，才能发挥抑制HIV1RT作用。它们全部是HIV1RT底物的竞争性抑制剂，抑制RT活性，阻碍前病毒DNA合成；并由于在结构上3′位缺乏羟基，当它们结合到前病毒DNA链的3′末端时，不能再进行5′→3′磷酸二酯键的结合,终止了病毒DNA链的延长，又为链末端终止剂。通过上述作用机制,抑制HIV复制。它们与HIV1RT亲和力远比与细胞内正常DNA聚合酶亲和力强，因此具有一定的治疗指数。艾滋病的治疗采用联合用药，即高效抗逆转录病毒疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART)。耐药突变［3］可分为基因型突变(genotype)及表型突变(phenotype)，基因型突变并不一定有表型突变，临床需分别进行两者检测。通常在RT分子中有一个氨基酸取代，即可引起表型突变。AZT是第一个上市的抗艾滋病药(1987年)，在临床应用时间较长，单个氨基酸取代可引起高度耐药突变的有M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y/F和K219E/Q，可使IC50降低>100倍，其中以T215Y/F为最重要的取代［4，5］。这些取代也可发生在d4T单药治疗，但耐药程度较低，在ddI单药治疗患者，也有10%发生以上突变，对其他NRTIs无交叉耐药。这一系列耐药突变的机制主要为焦磷酸依赖及ATP依赖的焦磷酸解作用(pyrophosphorolysis，聚合的逆反应)，以后者为主［6～8］。突变的RT可将引物(primer)末端结合的AZTMP切除，去掉AZTMP的链末端终止作用(deblock)，使DNA链重新开始聚合反应而延长。有报道在生理浓度ATP条件下［9］，突变的RT对8个NRTI的切除能力次序为AZT>d4T>ddC>ABC>DAPD>3TC>ddI>tenofovirDF，说明AZT及d4T主要通过ATP依赖的焦磷酸解修复机制产生耐药，对tenofovirDF此修复机制比AZT小35倍，比d4T小22倍。在有对应的新dNTP结合情况下，可抑制修复机制，但对AZT修复机制无影响，提示AZT这一系列耐药与其他NRTI无交叉耐药的机制。AZT与ddNs(指ddI及ddC)联合用药可发生另一系列的多药耐药突变，有多处取代(A62V、V75I、F77L、F116Y及Q151M)，其中以Q151M最重要。有3%～16%患者用AZT与ddI或ddC治疗可发生这类突变。体内对AZT敏感性下降为原有的1/179，对ddI、ddC及d4T的敏感性显著下降，但对3TC及tenofovir(TDF)仍敏感。Q151M及包含Q151M的突变RT的耐药机制为对ddNs的识别［10］，对ddNs的识别发生在RT活性中心的聚合过程，聚合效率降低，而不是在ddNs结合过程。在AZT突变的基础上(由胸腺嘧啶核苷衍生物AZT及d4T引起的突变称thymidineanaloguemutation，TAM)，还可发生插入或缺失突变［9，11］，产生高度耐药(>1000倍)。在69与70残基之间插入两个氨基酸称69插入突变，发生率1%。插入可为SS、SG、SA，在β3β4环，包括氨基酸残基6472，位于RT的手指区，使手指区移动性加大，并应用ATP依赖的焦磷酸解作用。缺失突变发生在67位置，此突变RT的分子机制为对ATP有高度亲和力，在低浓度ATP条件下，可发挥ATP依赖的焦磷酸解作用，切掉AZTMP及TDFMP。其他NRTI亦可引起单个取代的耐药突变及交叉耐药，如ddC引起的K65R，对ABC、ddI及TDF均有交叉耐药，含K65R或L74V变异的病毒复制能力下降［12～14］，对天然底物利用能力比野株低，对dATP、dGTP、dTTP和dCTP利用能力分别下降15%、36%、50%和25%，聚合效率野株RT>L74VRT>K65RRT>K65R/L74VRT。K65R可降低ddNTP分离的焦磷酸的稳定性。3TC引起的M184V，对3TC及FTC高度耐药(>100倍)，与ddC及ddI有轻度交叉耐药，分子机制为此突变RT的巨大的侧链(Val)与3TC/FTC的氧硫环之间发生空间障碍，影响两者的聚合反应。3TC的耐药变异可逆转齐多夫定耐药株，使其恢复对齐多夫定的敏感性，并可延缓齐多夫定耐药变株之产生［15］。临床研究显示，3TC耐药株的出现对联合用药(3TC+AZT)疗效影响不大，故3TC+AZT为HAART常用组成部分。D4T引起的V75T与ddC及ddI有交叉耐药，分子机制为此突变RT由于空间障碍，降低d4TTP结合效率。临床分离到的ddI耐药变株，在HIV1RT有两种主要突变类型L74V及M184V，两者对ddI敏感性分别降至1/10及1/4～1/8。ddI耐药毒株与AZT无交叉耐药，与ddC有交叉耐药。体外研究显示ABC累积4个取代(K65R、L74V、Y115F、M184V)可产生高度耐药，分子机制为影响聚合效率。体外ABC与ddI、ddC及3TC可能有交叉耐药，与D4T及AZT无交叉耐药。TDF体内外不易产生耐药，主要为K65R突变，临床有3%患者可分离此突变株，其对TDF敏感性下降3～4倍，无交叉耐药，ddC、ddI及ABC也有此突变。

1.3非核苷类逆转录酶抑制剂(nonnucleosidereversetranscriptaseinhibitor,NNRTI)耐药性及耐药机制属于NNRTI的抗艾滋病毒药物共有3个品种［奈韦拉平(nevirapine，NEV)、地拉韦平(delavirdine，DEL)和依非韦伦(efavirenz，EFV)］。NNRTI与接近活性中心的P66亚单位疏水口袋结合，与NRTI结合位置不同，是RT的非竞争性抑制药。NNRTI易引起耐药及交叉耐药［5，16］，常见引起耐药的单一取代有A98G、L100I、K101E、K103N、V106A、V108I、E138K、T139I、T181C、Y188C、G190A、F227L及P236L，以K103N最常见。单一取代显著引起空间障碍，降低NNRTI与RT的结合，如T181C对NEV敏感性降低>100倍，并有交叉耐药。EFV为第二代NNRTI，其分子结构较小，可结合耐药RT已重新排列的疏水口袋。如NEV对K103N的结合亲和力下降40倍，EFV只下降6倍，因此EFV仍对耐药株有效。体内外NEV极易产生耐药，临床单药治疗8周，100%患者可分离出耐药变株。HIV1RT突变部位主要是密码子181［17］，由酪氨酸→胱氨酸/丝氨酸，NEV耐药株仍对齐多夫定敏感，但与其他非核苷类HIV1RT抑制药有交叉耐药。体内外试验DEL也极易产生耐药变株，临床单药治疗8周，14/15患者之分离株对地拉韦定敏感性降低，仅为原敏感性的1/50～1/500。基因型分析，主要是密码子103及181发生突变［18］。临床分离株，EFV对HIV1RT单个核苷酸取代(密码子48、108、179、及236)株敏感性未变，对A98G、K101E、V106A、Y188C及G190A的敏感性降低<10倍，对L100I及K103N的敏感性降低20～70倍，对Y188L、S48T+G190S、K101E+K103N、K101E+L100I及K103N+V181C的敏感性降低>80～1000倍。EFV的耐药特征在联合用药的情况下没有改变，与其他NNRTIs有交叉耐药。

1.4蛋白酶抑制药(proteaseinhibitor,PIs)耐药性及耐药机制HIV蛋白酶由99个氨基酸组成，其活性形式为C2对称匀二聚体(相同二个亚单位的聚合体)，属天冬氨酰蛋白酶类。HIV基因组中gag及gag/pol基因各编码一多蛋白前体(p55及p160)，它们均需病毒蛋白酶酶解加工为成熟的结构蛋白和功能蛋白(病毒酶)。如HIV1蛋白酶发生变异或酶活性受到抑制，则生成没有感染性的不成熟的病毒颗粒，说明HIV蛋白酶是病毒复制的必需酶。属于PIs的抗艾滋病毒药物共有9个药物，即沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那韦(amprenavir，APV)、kaletra(洛匹那韦lopinavir,LPV和利托那韦复合制剂)、Atazanavirsulfate(ATV)、福司安普那韦［fosamprenavircalcium(FAV)］及tipranavir(2005/06/22上市)。HIV蛋白酶的单个氨基酸取代，引起低度耐药，需累积多个氨基酸取代，引起高度耐药及交叉耐药［5，19～,21］。耐药突变可发生在蛋白酶活性位置或非活性位置，第一代PIs(SQV、RTV、IDV、NFV)的常见突变为M46L/I/F、I54V、V82A、I84V、L90M。D30N及N88D为NFV特有的变异［22］。V82A及I84V位于蛋白酶活性位置［23］，引起酶活性中心结构改变，造成空间障碍，直接影响药物的结合。M46L/I/F及I54V位于蛋白酶的盖，影响其运动的分子动力学，间接防止药物的攻击。L90M位于蛋白酶非活性位置［24］，影响含有活性位置环的构型，降低底物结合口袋的可塑性及体积，障碍PIs与PR相互作用。这些突变的PR对正常底物亲和力也下降，使病毒复制能力下降。除以上位置突变外，在8、10、20、24、32、33、36、63、64、71、73、77位置也可见到耐药突变。APV至少需累积5个氨基酸取代才引起显著耐药，I50L是APV特有的变异。体内、外均已分离到对LPV耐药的变株，体外在逐步增加LPV浓度下，培养142d，可分离高度耐药变株，具有多处突变(I84V、L10F、M46I、T91S、V32I、I47V、V47A、G16E及H69Y)，IC50增加338倍。此株对利托那韦及沙奎那韦的IC50分别增加22及4倍。临床可根据HIV1分离株突变位置的数目，预测治疗反应率。当突变数为0～5、6～7及8～10时，临床反应率分别为91%、81%及33%。Atazanavir单药治疗50周所分离的耐药株，均有I50L突变，可伴有或不伴有A71V突变，此突变株对其他PIs敏感性增加。但Atazanavir与其他PIs联用时所分离的耐药株表现为交叉耐药的多药耐药，其突变位置为I84V、L90M、A71V/T、N88S/D及M46I。体内、外均已分离到对安普那韦耐药的突变株，其主要突变位置为I50V、V32I、M46I/L、I47V、I54L/M、I84V及P7/P1与P1/P6Gag及GagPol多蛋白前体裂解处。这些突变株在福司安普那韦单药治疗的新患者(未用过抗逆转录病毒药物治疗患者)中也分离到，与其他PIs有交叉耐药。

1.5HIV入胞抑制药耐药性及耐药机制HIV入胞抑制药目前只有一个品种上市，即FuzeonTM(T20，enfuvirtide)。体外可诱导T20耐药变株，基因型突变在gp41的3638残基，突变株对T20敏感性下降5～684倍；临床也分离到T20耐药变株，突变在gp41HR1(Nterminalheptadrepeat,NHR)的3645残基(Q32H/R、G36D/S、I37V、V38A/M、Q39R/H、Q40H、N42T/D/Q/H、N43D/S/K/Q、L44M、L45M、R46M、V69I)，对T20敏感性下降4～422倍［25，26］。在NHR与CHR(Cterminalheptadrepeat)连接处及CHR也可发生突变，位于HR2(CHR)的突变S138A伴发于43突变，使耐药性在原有基础上再增加3倍。V38A/M、N42T/D/Q/H、N43D/S/K/Q呈高度耐药，G36D/S、L44M、L45M的耐药程度较低，部分突变株的复制能力下降。近期报道［27］，有105%未用过T20治疗患者可发生耐药突变，基因多形性(polymorphisms)在HIV非B亚型及重组型发生率比B亚型多。不同取代与亚型有关：N42S发生在亚型A、B、G及C，不发生在亚型F；Q56R发生在亚型A(CRF02AG)；L54M发生在亚型B(CRF14BG)。

2抗乙型肝炎病毒(HBV)药

2.1抗HBV的治疗针对慢性活动性肝炎(CHB)，治疗的近期目的是持续降低病毒载量，ALT正常，改进肝病理及清除HBeAg；远期目的是防止肝炎进展为肝硬化，肝功失代偿及肝癌。当今临床应用的抗HBV药物有干扰素α(IFN)、拉米夫定(lamivudin,3TC)、阿德福韦二吡呋酯(adefovirdipivoxil，ADV)及恩替卡韦(entecavir，ETV，2005年3月上市)，前三药在临床应用较久，表1及表2比较三药疗效。三个化学药的作用靶位均为HBVDNA聚合酶/逆转录酶［28］。

2.2拉米夫定的耐药及耐药机制3TC抑制HBV复制，降低病毒载量效果显著，但易引起耐药。亚洲多中心研究报道，3TC用药1、2、3、4及5年，其耐药发生率分别为15%、38%、55%、67%及69%［29，30］。对HBeAg阴性患者，3TC的耐药发生率更高。因HBV复制率高［31］，每天产生约1011毒粒；由前病毒(前病毒RNA)进行逆转录时，HBVDNAP/RT缺乏纠错功能(proofreading)，无3′5′外切酶，每个复制循环，每个碱基的错配率为10-4；现有药物对核内cccDNA(共价闭环DNA)无抑制作用，cccDNA在感染细胞内存在一定拷贝数，使HBVDNA可持续复制等因素，HBV易发生耐药突变是可想象的。耐药是3TC临床治疗中的重要问题，也是新药开发必需考虑的问题。发生耐药株后，疗效下降，病情反复，原已降低的HBVDNA及ALT又上升，一般上升幅度较低，不超过治疗前水平。发生耐药突变后，继续用3TC治疗，对部分患者仍有疗效，肝病理变化继续改进，但也有41%患者病情加重，尤其在肝移植及HIV/HBV共感染患者可引起进行性肝硬化，肝病理损伤加重，甚至发展为严重肝炎。对已发生耐药突变患者［32～34］，是继续用药或停药或改用其他药物，文献报道结果矛盾，并且不同耐药株复制能力不同，是否继续用3TC治疗，应根据耐药株特征及临床肝病情况(肝功代偿或失代偿)，加以综合考虑，因人而异制定方案(表3)。HBVDNA聚合酶/逆转录酶可分五个保守的功能亚区［35，36］，耐药突变常发生在HBVDNA聚合酶C基序高度保守区YMDD(酪氨酸蛋氨酸天冬氨酸天冬氨酸)内，蛋氨酸被异亮氨酸(YIDD)或缬氨酸(YVDD)取代。最常见的变异为M552I/V及L528M/M552V，其他有L528M/M552I、A529T、V521L、L428V/I、L430M、V521L、A548V等。除前五个耐药突变株在体外研究较多外，其他研究较少，与耐药关联性不够了解。单个氨基酸的取代，就可引起高度耐药，如M552V(即M184V)对3TC的敏感性降低>1000倍。3TC出现耐药后，90%患者病毒载量及ALT水平上升，其上升程度低于治疗前水平。各突变株对3TC敏感性不一，其复制能力也不同，如M552I/V任一突变，使突变株复制能力下降；如两者分别合并有L528M突变，可使突变株复制能力恢复。3TC耐药机制有三方面：①YMDD突变可使3TC三磷酸的底物结合口袋构型改变，产生空间障碍，使3TC三磷酸结合能力下降；②3TC耐药株DNAP/RT的催化效率改变，使3TC进入HBVDNA效率降低；③3TC被焦磷酸解或ATP依赖的焦磷酸解将引物末端结合的3TCMP切除增加。V521L(B区)是在阿德福韦二吡呋酯(ADV)进行临床Ⅲ期试验时，对入选患者进行基础基因型分析而发现的3TC突变株，发生率为9%～23%［37］。其不改变野株或耐药株对3TC、喷昔洛韦及ADV的敏感性，但增加病毒复制能力。可能机理有2：其1为使HBVDNA模板再定位，因B区与模板定位有关。其2为影响与酶聚合反应有关的其他残基，V521位于接近催化中心的DNA模板下面，是一补偿性突变。由于其增加病毒复制效率，如患者发生此取代，不能再用3TC治疗。对A529T在体外进行研究时，发现其复制依赖3TC，但A529T突变使与pol基因重叠的外膜基因(S基因)产生一终止密码，使HBsAg及病毒分泌障碍。含有此突变患者，血清HBVDNA不上升，也不发生进行性肝炎加重。如发生其它依赖3TC复制的突变株，需停用3TC。由上所述可归纳几点：①基因型突变不一定同时伴有表型改变；②每一突变株，不论是单点突变或多处取代，该突变株需在体外进行特征研究，包括对药物敏感性、复制能力、复制是否依赖诱导突变的药物及对酶分子结构影响的机理等；③临床观察耐药是否与此突变有关。可见，每一突变株的研究是很复杂的。对HBV感染进行肝移植患者，术后一般用3TC或3TC+HBIg治疗，以预防HBV复发。HBIg诱导的耐药突变，常发生在HBVDNAP/RT的AB间区。大规模HBV疫苗接种也可诱导突变株，逃避疫苗的保护作用。如台湾于1984年开始大规模HBV疫苗接种，10年后发现在HBV慢性携带者体内HBV逃逸变株由8%上升到28%。这两种突变株对3TC均敏感，长期应用3TC治疗，在原变异的基础上可再诱发3TC耐药突变，使治疗失败。3TC耐药株与其它抗HBVL型核苷衍生物(FTC、telbivudine)及泛昔洛韦、恩替卡韦(恩替卡韦高剂量可克服交叉耐药)有交叉耐药。

表1HBeAg阳性的CHB对抗病毒治疗反应（略）

表2HBeAg阴性的CHB对抗病毒治疗反应（略）

*IFN及3TC：分子杂交；ADV：PCR；NA：未测定。

表3治疗CHB的建议（略）

*HBVDNA>105拷贝/ml；#DDW04：2004年美国消化道疾病周国际会议［28］。

2.3阿德福韦二吡呋酯的耐药及耐药机制［38，39］ADV为核苷酸衍生物，临床应用中不易产生耐药突变，用药1年、2年、3年及4年的耐药突变率分别为0%、2%、5%～6%及18%。近期报道124例HBV患者接受ADV治疗96周，在2例患者发现N584T(即N236T，D区)突变，体外该突变株对ADV敏感性下降<10倍。计算机分子模型研究，N584T失去两个氢键，使静电作用显著下降，影响了ADV的结合效率。ADV耐药变株对3TC、FTC、telbivudine及恩替卡韦仍敏感。计算机分子模型研究，ADV对典型3TC耐药株(L180M、M204V/I、L180MM204V/I)敏感性上升的原因为增加了范德华引力，并对天然底物的亲合力下降。

2.4恩替卡韦的耐药及耐药机制［40］ETV为核苷衍生物，对HBV野株及3TC耐药株具有很强的抑制作用(表4)［33］，临床长期应用对3TC耐药患者疗效明显，并且不易产生耐药突变。Tenney［40］报道恩替卡韦Ⅱ期临床试验中，有2例患者发生病毒反跳，出现耐药突变。患者A用3TC治疗54周后，用ETV05mg治疗52周，继用ETV及3TC100mg治疗89周，病毒反跳发生在ETV开始用药后的133周。耐药株基因分析，在原3TC耐药突变的基础上(V173L/L180M/M204V)又增加两个突变(I169T及M250V)，体外研究对ETV敏感性降低除原3TC耐药突变外，还需M250V取代。患者B为肝移植病人，用ETV前，曾用过泛昔洛韦、更昔洛韦、磷甲酸钠及3TC，均治疗失败。耐药株有多处突变(S78T/V173L/L180M/T184S/M204V)。病毒反跳发生在用10mgETV76周后。耐药株基因分析，在原耐药突变基础上，又增加三个突变(T184G/I169T/S202I)。体外分析，当T184G及S202I与3TC耐药突变共存时，对ETV敏感性降低最多。因此，ETV长期用药，若在3TC耐药突变的基础上，加上ETV特有的耐药突变，可使治疗失败。

表4抗HBV药物对HBV野株及3TC耐药株的IC50及在10μmol/L浓度下的复制能力（略）

LD4FC：2′3′二脱氧2′3′二脱氢βL5氟胞啶核苷；LFMAU：2′氟5甲基βL阿糖尿嘧啶；DDAPD：二氧戊环鸟苷前药。

3抗流感病毒药

3.1抗流感病毒药的作用靶点［41］临床应用的抗流感病毒药有金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦及奥塞米韦4个品种。金刚烷胺及金刚乙胺上市较早，两者只抑制流感病毒甲型。金刚烷胺对流感病毒M2蛋白离子通道的作用与其抗病毒作用机制有关。两者作用机理相同，均为笼状化合物，作用于病毒四聚体穿膜蛋白M2离子通道，阻碍H+离子由酸化的内体通过M2离子通道进入毒粒内部，不能降低毒粒内部pH,从而不能诱导酸依赖的HA构型改变，阻碍病毒外膜与内体膜(浆膜)融合，使病毒基因组复合体不能进入胞浆。两者作用于病毒吸附后到病毒外膜与内体膜融合这一时间段。扎那米韦及奥塞米韦(达菲)为1999年上市新药，两者为流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase，NA)慢结合抑制剂，对甲、乙型流感病毒均有抑制活性。扎那米韦及奥塞米韦也是利用计算机辅助设计成功开发的典范。近年由于禽流感(H5N1)的暴发，WHO一再警告流感的大流行。据报道奥塞米韦在临床上对禽流感患者有效，与禽流感病毒接触过的人只要在48h内服用奥塞米韦，可不出现禽流感症状。发达国家都在增加奥塞米韦的库存，英国及法国均订购了供1500万人份使用的药量，美国也订购了供230万人份使用的药量。

3.2金刚烷胺的耐药及耐药机制［42］体内、外流感甲型病毒对金刚烷胺均易产生耐药，耐药与编码M2蛋白基因的单个核苷酸突变有关，与抗性有关的突变主要发生在位于跨膜域α螺旋区的26、27、30、31及34位氨基酸，以31位突变最常见，该区域为金刚烷胺类药物作用靶点。突变株的毒力不降低，仍可在人群中引起感染，约30%的成人及儿童在治疗的d5～7天可分离耐药株，耐药株对扎那米韦、奥塞米韦及利巴韦林仍敏感。

3.3扎那米韦及奥塞米韦的耐药及耐药机制［43，44］神经氨酸酶广泛存在动物及微生物中，是一种苷水解酶，可将细胞表面以苷键连接在糖蛋白和糖脂上的唾液酸水解，在微生物的感染和传播中发挥重要作用。流感病毒神经氨酸酶是病毒复制的关键酶，破坏细胞表面病毒血凝素(HA)受体，协助子代毒粒由感染细胞表面释放，防止毒粒聚集，促使毒粒通过呼吸道黏液，有利于其在呼吸道黏膜扩散。体外及临床均发现病毒神经氨酸酶的耐药变异毒株(表5)，扎那米韦治疗的正常患者未分离到耐药株。奥塞米韦治疗患者，1%成人患者及5%儿童患者可分离到耐药株，儿童患者易产生耐药突变，用药d4即可分离到耐药株。耐药变异毒株的复制能力下降，对小鼠及雪貂的毒力、致病性扎那米韦及传染性均较野株弱，其临床意义不明。耐药取代特征与病毒型有关。对His274Tyr分子耐药机制研究，发现His274Tyr及His274Phe变株NA对奥塞米韦敏感性降低是因取代氨基酸的侧链大，影响Glu276的再定位(奥塞米韦结合需Glu276再定位reorientation)。如以侧链较小的Gly、Asn、Ser及Gln取代，则对奥塞米韦敏感性增加或不改变，但对扎那米韦敏感性降低。流感病毒A/Tokyo/3/67(H3N2)的His274Tyr取代，不影响对奥塞米韦及扎那米韦的敏感性。说明274位氨基酸侧链的体积影响流感N1NA对奥塞米韦及扎那米韦的敏感性，但不影响N2NA对奥塞米韦及扎那米韦的敏感性。

表5（略）

4抗疱疹病毒(HSV)药

4.1抗疱疹病毒药的作用靶点临床应用的抗疱疹病毒药有近20个品种，绝大部分为核苷或核苷酸衍生物，作用靶点为HSV编码的DNA聚合酶(DNAP)，作为酶天然底物的竞争性抑制剂，抑制酶活性，阻碍病毒DNA合成，并终止病毒DNA链的延长。它们均需在细胞内转化为活性三磷酸或二磷酸衍生物，才能发挥抑制HSVDNAP作用。第一步磷酸化是限速因子，与HSV编码的胸腺嘧啶核苷激酶(thymidinekinase,TK)有关。

4.2阿昔洛韦(ACV)的耐药及耐药机制［45］阿昔洛韦(aciclovir，ACV)于20世纪80年代初上市，由于其高效低毒，被誉为抗病毒药物发展史的里程碑，直到目前阿昔洛韦仍为抗单纯疱疹病毒首选药物。ACV是一开环核苷，其活性化合物为阿昔洛韦三磷酸。阿昔洛韦第一步磷酸化依赖单纯疱疹病毒基因编码的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)，该酶只存在于单纯疱疹病毒感染的细胞内，正常细胞内无此酶。因此只有在感染的细胞内阿昔洛韦才能进行关键的第一步磷酸化，生成阿昔洛韦一磷酸，以后在细胞核苷酸激酶的催化下，相继生成阿昔洛韦二磷酸及阿昔洛韦三磷酸，后者发挥抗病毒DNAP作用。免疫功能正常患者发生ACV耐药突变很少(<1%)，免疫功能降低患者发生ACV耐药突变率为35%～86%，尤其是骨髓移植患者高达14%。耐药突变与TK及DNAP的基因突变密切相关，其机制有3种：①TK缺失突变，病毒不能表达TK；②TK底物特异性改变；③DNAP活性改变。95%ACV耐药株为TK缺失表型，对动物致病力降低。TK为UL23基因编码，含376个氨基酸，有6个保守区(5066、7991、162178、212226及281292)。1/2耐药株为核苷酸的插入或缺失，另一半为取代，后者常发生在HSV1的176位及336位，HSV2的177位。DNAP为UL30基因编码，含1235个氨基酸，有8个保守区，40%的突变发生在Ⅱ区及Ⅲ区。

5如何预防耐药突变

(1)患者用药的依从性患者用药依从性对预防耐药突变非常重要，防止不规则用药或任意中断用药。BritishColumbiaCenter观察1200例HIV患者耐药发展情况，发现服药依从性是是否产生耐药的最强因素。(2)采取最佳联合用药方案及剂量，以降低或延缓发生耐药。(3)治疗前了解感染毒株对药物敏感性。(4)用药早期，监测病毒载量，观察患者对治疗反应，及时调整治疗方案。

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突变范文篇6

关键词害虫，抗药性，进化，起源，遗传，机制

害虫对化学农药的抗性进化历史不到100年，就已经有500多种害虫对一种或多种杀虫剂产生了抗性。害虫抗药性的进化导致化学防治的失效，给农业产量造成很大的经济损失，例如据Palumbi估计，在美国每年由于害虫产生抗性导致的损失至少有30多亿美元，这其中包括由于抗性加大农药使用的额外消费以及抗性害虫对农产品的直接损失。

早在1951年Dobzhansky就认为，杀虫剂抗性是一种进化现象。遗传分析可以有助于研究抗性机制和制订抗性治理策略，是研究抗性的一个主要工具。本文从遗传角度对抗性进化的本质进行探讨，并归纳分析抗性基因突变的主要类型，以期对害虫抗药性的进化的有更好的理解。

1、害虫抗药性进化的遗传起源

1.1遗传变异是害虫抗药性进化的基础

由于害虫对杀虫剂的抗性是生物进化的一个特例，可以从生物进化角度对害虫抗药性进化进行分析。生物进化的基础是生物遗传结构的不稳定性即遗传的相对保守性和变异的绝对性，这种变异的绝对性结合环境的复杂性造成了生物的多样性，给生物进化带来可能。诱导变异大致分2种情况，一种是生物在自身的遗传体系中发生的变异，这种变异具有普遍性；另一种是由外在的多样化的环境条件诱导的(包含辐射诱导、化学和物理诱导等)。

在药剂选择前，害虫种群内存在着大量的变异，这其中就包括在历史进化过程中由于自身的繁殖发育而产生的遗传变异和由于外在的环境诱导的变异。这些变异是抗性进化选择的原料，故药剂首先作为抗性基因型的选择剂存在，这符合“前适应假说”的解释。最近一个研究报道很好地证明了这个假说，Hartley等研究表明在采自于杀虫剂应用前的澳大利亚羊绿蝇Luciliacuprina品系中检测到对马拉硫磷的抗性。但这不是说药剂不会诱导抗性发生，若药剂长期作用，害虫种群肯定会慢慢适应进化出对应的变异，但这类变异的进化过程很漫长，远远不及药剂的选择作用快，故药剂普遍作为选择剂。药剂除了可能对遗传变异有诱导作用的可能之外，还有可能存在对抗性变异的促进作用，如杀虫剂可以促进基因扩增，从而促进抗性进化。

通常变异是不利性，因为其干扰了在历史长河中进化而成的正常稳定的遗传结构。若无外在的定向选择作用，此变异会因随机性而以极低频率存在，甚至会被自然选择所淘汰。也就是说，只有当外在的选择对某种变异有定向的筛选作用时，此变异才呈定向性。所以说害虫抗药性的进化是定向选择，而不是定向变异的结果。

遗传变异是害虫抗药性进化的基础，原始野生害虫种群中存在大量频率极低的变异等位基因，这些基因都是杀虫剂选择的原材料。杀虫剂选择是抗性进化的主要动力，即人类是进化的最大驱动力。因此被杀虫剂选择的变异基因的频率上升就是害虫抗药性进化的本质。

1.2基因重复为遗传变异提供了原材料。是抗性进化的主要根源

突变是所有遗传变异最本质的起源，但是从短期来看，普遍认为基因重复是新基因功能的主要原材料。理论认为基因重复在初期阶段导致功能过剩，基因重复后，早期存在对保留原始功能的基因拷贝具有正向选择(positiveselection)作用，即其它重复基因有可能会简单地通过退化突变(degenerativemutations)而成为沉默基因或无功能基因，因随机漂变而生存下来。又因为大部分突变对适合度是有害的，故所有模型预测这种无功能化(non－functionalization)是最常见的情况。极少数情况下，在一个基因拷贝保留原有的功能的基础上另一个拷贝可能接受了一个新的有益的功能，通过自然选择而被保持下来也即是新功能化(neofunctionalization)过程。虽然基因重复被进化成新功能的几率很罕见，但这些重复基因的随机沉默对新物种的被动起源进化起了明显作用。

由于抗性进化是一种进化现象，基于以上理论，抗性基因变异的主要原料是基因重复，其进化实质是由原来的基因进化成具有新功能(表现为抗性相关)的基因。进一步推论，与抗性相关的变异基因在药剂选择前有2种存在可能，一种是抗性变异基因以沉默基因形式存在于害虫基因组中，即基因重复后这些无功能基因因随机漂变而生存下来。现研究证明了抗性基因家族中存在沉默基因，如冈比亚按蚊Anophelesgambiae的P450家族下的5个成员是假基因，GST家族的一个基因(GSTd6)也可能是无功能基因。又如研究证明无效等位基因met调控met基因的转录水平引起保幼激素(JH)受体基因met的产物完全消失导致保幼激素类似物(JHAs)抗性产生。另一种可能是抗性变异基因以功能基因形式寄存在害虫个体内随机存在，因变异基因大部分伴随着适合度的下降，其存在几率极低，也就是抗性等位基因初始频率很低。

因此，药剂对抗性基因的选择作用也可以分成2种，一是在基因组中对抗性基因的选择作用，即有利于在药剂选择压力下生存的变异的无功能等位基因渐渐取代基因组中原始基因拷贝的主导地位的过程。另一种是对抗性基因型的选择作用，即对抗性基因的寄主——表现为抗性的害虫个体的筛选。由于害虫种群中随机存在着抗性个体，而且沉默基因取代原始基因的过程很慢，故一般情况下药剂直接对抗性基因型进行筛选。但是若从田间采集昆虫在室内进行抗性筛选时采集的试虫基数很小，很可能该昆虫群体中没有抗性变异的害虫个体来配合药剂的筛选，这种情况下对抗性基因的选择作用就有可能出现，但抗性上升速度很慢。

2、害虫抗药性进化的分子机制

由于基因重复后导致的功能过剩，重复基因由于不受功能上的限制，很可能会出现丰富多样的变异类型，所以说抗性基因变异机制很丰富。但在多样化的基因变异中，又有一定的规律性，如靶标位点的点突变导致抗性的机制是靶标抗性机制的主要形式，基因扩增或基因过表达导致的代谢酶上调是代谢抗性的重要机制。这种规律性是由在自然选择下对基因变异的随机选择作用和在药剂选择压下对更适应此环境的变异的定向选择作用共同导致的。这也说明抗性基因的变异机制的存在受到其本身所伴随的适合度代价(fitnesscost)和对药剂选择压的适应能力的影响。

从现有的害虫抗药性事例来归纳，抗性基因变异主要有以下3种机制。

2.1结构基因的变化(genestructurechange)

现有的害虫抗药性研究表明基因结构的变化机制主要是点突变(其中绝大部分是属于单个点突变)。

2.1.1点突变点突变有2种机制，一种是无义突变(nonsensemutation)，即某个核苷酸的突变导致了终止密码子(如ATT)的出现，使转录提前终止。例如昆虫对生物农药Bacillussphaericus(球形芽孢杆菌)的抗性机制就是无义突变。其抗性机制为编码毒素结合蛋白Cpm1蛋白的Cpm1基因发生点突变，导致翻译的提早终止，使Cpm1的疏水末端被切除，阻止了Cpm1蛋白与胞质膜的结合，使毒素的杀虫作用消失，但对毒素与Cpm1蛋白的结合没有影响。另外一个事例是Xu等报道由于一个提早终止密码子的出现导致一个钙粘素基因Ha-BtR的分裂与棉铃虫Helicorverpaarmigera对Bt抗性紧密联系。

另一种突变机制是错义突变(missensemutation)，即基因的编码区中的一个核苷酸被另一个不同的核苷酸取代，导致产生不同的氨基酸，使基因产物的三维结构发生变化而产生抗性。由于三维结构的改变而导致与其作用部位结合能力的降低或增加(靶标抗性机制)，或降低基因产物对杀虫剂的代谢能力(代谢抗性机制)。这种结构的改变并不改变产物的量，而是改变产物的质。大多数杀虫剂都是以一个关键蛋白作为靶标，现研究表明Ace.Nla.Rdl.para.met基因的点突变就可相应地导致杀虫剂靶标受体——昆虫体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)、乙酰胆碱烟碱受体(nAChR)、γ－氨基丁酸(GABA)受体、钠通道、保幼激素(JH)受体的结构的变化，从而导致昆虫个体对相应的杀虫剂的靶标抗性产生。另外，也有研究表明代谢酶如酯酶的基因结构的改变，可导致基因产物代谢酶的质的变化，从而导致昆虫个体对相应的杀虫剂的代谢抗性产生或变化。

靶标位点的点突变所造成的变异程度相对于其他变异机制而言是较弱的，这样的基因相对保守性既保证了虫体内在机能的正常运作足以使其存活下来，又使杀虫剂结合能力下降，从而表现出对杀虫剂的抗性。因此在以靶标机制作用的杀虫剂的选择压下，靶标位点的点突变更具有生存的优势。

2.1.2基因重组一个品种中可能同时存在几个突变的组合，这样可导致更高水平的抗性产生。如Mutero等将在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster的不同抗性品系的Ace基因中发现的不同点突变的组织进行表达后发现，高水平的抗性可能是由不同点突变的组合所引起，这些点突变单独存在时只表达很低的抗性；Kozaki等也证明了Ace内的多点突变和基因内重组能使害虫的抗性明显增加。

基因重组增加了异常等位基因的数量和频率，因此对抗性基因进化有重要的影响。Mmem等认为自然种群中存在的抗性等位基因之间的重组是害虫迅速适应新的选择压的一个机制。几个点突变的重组可产生较高的抗性水平，但同时也造成了较大的适适合度代价。当有杀虫剂选择压时，单个突变可以通过重组形成产生较高的抗性杂合子的种群而生存下来，当无选择压时，有多个点突变的个体可以和敏感个体杂交而保存抗性突变，具有这种杂合子的种群也具有一定水平的抗性，最初表现出一定的杂种优势。但随着杀虫剂选择压消退，这种杂种优势也渐渐退化。

2.1.3移码突变——基因缺失与插入染色体的缺失具有很大的致死性，这对生物个体的生存非常不利。目前在抗药性基因的研究中也发现抗性基因或基因片段的缺失机制。如Morin等报道抗Bt棉红铃虫Pectinophoragossypiella品系的3个钙粘素突变等位基因都发生了氨基酸的片段缺失；苏建亚报道棉铃虫抗性品系对Bt棉高水平抗性是由于钙粘素基因发生了大片段缺失突变所至。Gahan等报道的因反转座子介导的序列插入导致钙粘素基因家族的一个基因的突变是一种基因序列的插入机制。

由于移码突变相对于错义突变而言，其变异程度较大，并伴随较大的适合度代价，故在药剂选择前这些突变的存在几率就相对较低，而且药剂选择后对生物个体的生存也不利，因此发现移码突变的抗性机制的事例不是很多。

2.2基因扩增

基因扩增是生物对环境有害化学物质产生抗性的一种基本而普遍的机制。一个基因扩增的结果是在DNA中呈现该基因的许多拷贝。基因扩增和基因表达的改变导致基因产物的过表达是代谢抗性的主要机制。

对于酯酶介导的抗性，基因扩增是酯酶过表达引起抗性的主要机制。例如这些酶的产物过量在桃蚜Myzuspersieae，库蚊Culicinemosquitoes以及褐飞虱等昆虫体内被证实。

然而，大部分抗性品系P450s过表达的事例不是由基因扩增引起，但Nikou等报道通过southern印迹分析法，发现基因扩增是菊酯抗性按蚊A.gambiae品系的CYP621基因过表达的一个原因。

另外，目前尚未发现GST酶系的基因扩增与杀虫剂抗性有关。这表明在GSTs引起的抗性中，若不是全部但至少是大部分事例似乎与基因扩增无关。

基因扩增的机制可能有转座子(transposableelement)或可移动因子(mobileelement)的作用、跳远式重复(saltatoryreplication)、无插入序列的头尾连接式(hcad-to-tailtandemfashion)排列方式、姐妹染色体间的随机不平等交换(randomunequalcross-over)以及基因重复后误排导致串联重复(tandemrepeat)等机制。

在代谢抗性中，解毒酶的量变更有利于害虫在维持虫体的生存的基础上对毒物的不利作用的抵抗。由于中等水平的基因扩增的变异速率较高且其多效性适合度下降(Dleiotropiefitnesscost)较弱，基因扩增机制在代谢酶的上调节中很普遍。

2.3基因表达的改变

这类机制在与抗性相关的GSTs和P450单加氧酶系中已被证实，但是虽然基因调节可以解释酯酶A1的产物过量，可尚未在酯酶介导的代谢抗性中发现。

基于GSTs的抗性的分子基础已在家蝇Muscadomestica及蚊类昆虫A.gambiae和Aedesaegypti中很好地被研究。在所有的事例中，抗性昆虫的GS％上调节是由于反式上调作用引起；而在P450s的转录调节中，顺式或反式作用都有可能。

目前，许多事例研究发现了抗性品系的P450s过量表达，例如，抗DDT果蝇D.melanogaster品系的CYP6A2和CYP6G1基因的过表达、抗二嗪磷家蝇肘，domestica品系的CYP6A1基因过表达、抗菊酯棉铃虫(H.armigera)的CYP687基因过表达、抗菊酯库蚊品系的CYP6E1基因过表达、抗菊酯按蚊A.gambiae品系的CYP621基因过表达，以及抗溴氰菊酯库蚊C.PiPienspallens品系的CYP6F1基因过表达等。

当药剂直接以毒物形式作用于虫体时，解毒酶的上调节导致抗性增加；而当药剂作为前体杀虫剂应用即须先被代谢成毒物，代谢酶的下调节将增加抗性。这种机制有许多事例，但分子机制尚不祥。例如，在Bt抗性中，就可以通过蛋白酶下调引起Cry毒素的活性下降从而导致抗性。

在靶标抗性中也有关于基因表达的改变导致的抗性机制的报道，如钠离子通道的para基因的反式下调作用(trans-down-regulation)机制。

另外，Wilson和Ashok试验证明JH受体基因met的产物完全消失(也就是基因沉默现象)导致抗性产生，并证明了是由无效等位基因met调控met基因的转录水平引起的。JH受体蛋白不是个体生存所必需的，也就是说编码JH受体蛋白的基因是无效基因(nullgene)，分子分析已证明JH抗性基因met是无效基因。因这些无效基因的缺失或沉默导致受体蛋白的消失或其功能消失从而能使抗性产生，而且适合度下降的程度也不会很大。假如这种推测被验证是正确的，那么无效基因的变异就拓宽了抗性基因变异范围，使害虫对杀虫剂选择压的适应范围加大。

另外，小幅度的缺失、插入和调控元件的转座可能会扰乱基因表达的空间和时间形态，从而导致抗性。

虽然基因表达的调控方式多样，但是代谢酶的上调机制在代谢抗性中很普遍。

突变范文篇7

要考虑汇率、外汇储备与国内通货膨胀三者之间的关系，必然涉及产品市场、货币市场以及国际市场。因此，本文借助于产品市场的IS曲线、货币市场的LM曲线以及国际收支的BP曲线将三者联系起来，从而分析其中的具体关系。产品市场均衡时：IS曲线为Y=c(y)+i(r)+g+nx(y,e,p,pf)（1）将消费函数、投资函数以及净出口函数代入上式得y=α+e+g+q-βt+nEpfp1-β+γ-d1-β+γr（2）y=L1+L2r（3其中L1=α+e+g+q-βt+nEpfp1-β+γ；L2=-d1-β+γr式中d为投资对利率的敏感系数，e为自发投资，α为自发消费，β为边际消费倾向，t为税收，g为政府购买，E为汇率、Pf为国外价格，P为国内价格，y为国民收入，r为利率，γ表示边际进口倾向。q，n为进出口函数中的相关参数。货币市场均衡时：LM曲线为f(y,r)=M/p（4）进一步的r=kyh+Mph（5）其中M/P指实际货币供应量，k为货币需求对收入的敏感性，h为货币需求对利率的敏感性。国际资本市场:国际收支曲线：BP=nx-F（6）将净出口函数以及资本流出函数代入上式得r=BP-q+γy-nEpfp+σrfσ（7）其中，BP指国际收支项，当国际收支平衡时BP为零，pf为国外的价格，rf为国外的利率，σ为资本流出函数中的参数由（1）（2）（3）联立得p=Mσ(Kσ-hγ)(L1-L2r)-h(BP-q-nER+σrf)（8）其中ER=Epfp表示实际汇率即可以简写成p=f(BP,ER,M,r,rf)（9）由于BP反映了国际收支的具体状况，因此其反映了我国外汇储备的增减，从而用外汇储备的变动代表BP,（4）式变为P=f(FER,ER,M,r,rf)（10）由上式可知，汇率、外汇储备等变动均会对物价水平产生影响。具体而言当外汇储备增多时，物价水平会呈上升趋势；当汇率上升时，物价水平则会下降。

实证模型

（一）结构变化单位根（ZA）检验传统的单位根检验（ADF、DF-GLS以及PP检验）并没有考虑数据发生结构突变的情形。Perron对在结构突变是外生给定的情形下的单位根进行了研究，发现结构突变将使常规的单位根检验无效。而通常而言，结构突变均被认为是内生的，因此，Zivot和An-drews避免了perron的结构突变外生化的假定，利用数据的自身特征找出其结构变化点，从而实现结构突变内生化。本文则沿用Zivot和Andrews的内生结构突变的方程检验形式。这一检验的具体模型如下：模型A：截距项发生突变的方程Δyt=c+αyt-1+βt+θDUt(λ)+kj=1ΣdjΔyt-j+εt（11）模型B:时间趋势项均发生突变的方程Δyt=c+αyt-1+βt+γDTt(λ)+kj=1ΣdjΔyt-j+εt（12）模型c:截距项与时间趋势项均发生突变的方程Δyt=c+αyt-1+βt+θDUt(λ)+θDUt(λ)+kj=1ΣdjΔyt-j+εt（13）以上三个模型的原假设均是α=0,即原序列是不含有结构突变的单位根序列，备则假设则是α<0，即yt是结构突变的趋势平稳序列。其中，TB为结构突变发生的时间，λ=TB/T,表示突变点发生的具体时点位置，DUt是一个表示其截距项发生结构突变的虚拟变量，而DTt则是其斜率项发生结构突变的虚拟变量。DUt=1t>TB0otherwisτeDTt=t-TBt>TB0otherwisτeZA检验把时间段内的样本点都看成潜在的结构突变点ti（i=1,2…），并对每一个点逐次进行单位根检验，从而计算t统计量，从中选取最小的t值，然后与相应的临界值比较，若大于临界值则接受原假设，反之，则拒绝原假设。（二）结构变化协整（GH）检验在探讨变量之间的长期关系时，通常采用的协整检验常常会忽略结构突变对此的影响，对此，GregoryandHansen将zivotandAndrews的方法推广到协整领域，提出了内生结构突变的协整检验，其备则模型具体形式如下：模型A：截距项存在结构突变(C)y1t=u1+u2Dtτ+αTy2t+εtt=1.2….n（14）其中μ1表示改变前的截距，μ2表示结构变化发生后截距项的偏移。模型B：含时间趋势的截距项存在结构突变(C/T)y1t=u1+βt+u2Dtτ+αTy2t+εtt=1.2…n（15）模型C：截距项与斜率均发生结构突变(C/S)y1t=u1+u2Dtτ+αTy2t+αT2y2tDtτ+εtt=1.2…n（16）其中虚拟变量Dtτ定义为：Dtτ=1t≤[nτ]0t>[nττ]以上三个模型的原假设是序列不存在协整关系，备则假设则是序列存在协整关系且发生过结构突变。式中,Dtτ为虚拟变量，刻画模型的结构变化，参数τ为结构突变点在时间序列的相对位置，[]表示取整运算。同样，仍假定每一个样本点均是潜在的结构突变点，然后对每一个点逐次回归得到残差序列，对残差序列进行单位根检验，进而算出每一个点对应的统计量，从中选取最小的值，然后将统计量与临界值进行比较，最终作出判断。

实证检验与分析

（一）数据来源本文以区间为1994年1月到2011年9月的共计213个数据作为样本数据。其中，人民币实际汇率（RER），为了真实反映人民币实际价值，采用国际清算银行公布的人民币实际有效汇率的月度数据；国内市场物价水平采用居民消费价格指数（CPI）的月度数据来衡量。外汇储备(FER)的数据则来源于外汇管理局网站的外汇储备月度数据。对于月度数据，常常需要对此进行季节调整，以便消除季节变动对结果产生的影响，从而更好地反应季度序列的特征和基本趋势。本文采用X-11法对数据进行调整，调整后的数据标以sa，然后对调整后的数据取自然对数，以消除时间序列的异方差，从而最终变量分别为：LFERsa、LR-ERsa、LCPIsa。（二）数据平稳性检验对于时间序列，需要分析数据的平稳性,否则会出现伪回归的问题，因此首先对各变量进行ADF检验,如检验发现是单位根序列，再对此进行ZA单位根检验，进一步判定是否是结构突变的趋势稳定序列，如果检验发现序列是平稳序列，那么对此进行ZA单位根检验则纯属多余。因此，先对以上各位变量做ADF检验，结果如下。表1变量的ADF检验结果注：其中C,T,N分别表示常数项、趋势项与滞后阶数由ADF检验可以看出，外汇储备、真实有效汇率、物价水平均是单位根序列，且是一阶单整序列，因此为了更精确地反应数据之间的统计特征，以防把结构突变的平稳序列看成是单位根序列，下面对这些变量进行ZA单位根检验，检验结果如下：表2LFERsa、LRERsa、LCPIsa的ZA单位根检验结果注：za检验在1%、5%、10%的临界值分别为-5.34、-5.08、-4.82由表2的ZA检验结果可知：外汇储备、真实有效汇率以及物价水平均是不平稳的，且是一阶单整过程，这进一步证明了上述三个变量的单位根过程。其中外汇储备的变化时期是在2004年1月，真实有效汇率的结构变化时期是在2002年3月，这可能是因为自从2001年12月中国正式加入世贸组织以后，对外贸易环境得到了变化，进出口总额发生了很大的改变；同时，北京申奥成功也促使国内出现了新一轮的投资热潮，再者，在2003年，人民币升值预期形成，大量游资开始涌入国内，这些因素都会对汇率、外汇储备产生影响。而物价水平的结构变化时期则发生在1997年1月，这可能是因为当时实行的宏观经济政策所致，经济增速自1993年起加快，物价水平曾一跃上升到1994年的24.1%，抑制通货膨胀是当局的首要任务，通过综合治理，使得国民经济至1996年底成功实现软着落，物价水平大幅度下降。（三）数据相关性检验1、人民币汇率与物价水平的关系。由于LRERsa、LCPIsa、LFERsa这些变量差分后都通过了单位根检验，且都是一阶单整变量，所以对此进行协整检验以考察两者之间是否存在一种长期稳定的关系。而由于传统的协整检验并没有考虑结构变化对变量间长期稳定关系的影响，因此为了更全面地考察变量间的协整关系，我们对变量进行了考虑结构突变的GH协整检验，检验结果如表3。表3物价水平与汇率之间的GH检验结果注:1.ADF*、Zt*、Zα*为GH协整检验三个检验统计量,临界值表参阅文献[1];2.**分别表示在5%的显著水平上拒绝零假设,即变量间存在该形式的协整关系。下同表3分别给出了这两变量间三种GH检验备则模型的检验结果，发现，三种模型中，无论是ADF*统计量，还是Zt*或者Za*统计量均不能在10%的显著性水平上拒绝原假设，这说明汇率与物价水平间不存在任何形式的双变量协整关系，即汇率与物价水平间不存在长期稳定的关系，也表明汇率并不会引起物价水平的变动，物价水平的波动也不会带来汇率的相应变化。这与理论推导的结果不一样，可能是因为我国现阶段汇率仍缺乏足够的弹性，且汇率与物价水平两者之间的传导机制仍没有打通，从而导致两者之间的互动不是很显著。2、外汇储备与物价水平的关系。表4物价水平与外汇储备之间的GH协整检验结果由表4可知，当外汇储备作为解释变量，物价作为被解释变量进行GH检验时，在5%的显著水平上，C/S模型的ADF*统计量检验拒绝了其原假设，这说明物价水平与外汇储备之间存在C/S形式的协整关系，且存在着结构突变。而当把物价作为解释变量，外汇储备作为被解释变量做GH检验时我们发现两者间不存在任何形式的协整关系。这说明这两变量间存在单向的协整关系，外汇储备的变动引起了物价的变动，而物价的变动并没有影响到外汇储备的波动。为了考察外汇储备的具体变动是如何对物价水平产生影响的，下面对C/S形式的协整方程进行估计。根据C/S结构变化形态方程的形式设方程的具体形式如下：LCPIsat=γ1+γ2Dtτ+γ3LFERsat+γ4LFERsatDtτ+εtt=1.2…n…（17）其中γ1表示发生结构变化前的截距，γ2表示结构变化发生后截距的偏移，γ3表示结构变化前斜率的系数，γ4表示结构变化发生后斜率的偏移，Dtτ表示发生结构变化的虚拟变量，参数τ为结构突变点在时间序列中的相对位置，由表5可知τ=0.211268，而本文的样本容量为213个，因此结构变化发生的时间点为1997年9月，虚拟变量Dtτ取值如下：Dtτ=1t≤1997.90t>1997.≤9因此，利用eviews对这一模型各变量的系数进行估计，结果如下：LCPIsa=5.641-1.144D-0.139LFERsa+0.154LFER-sa.D（18）(119.49)(-23.23)(-19.29)(20.78)其中括号内的数值表示t统计量，回归结果表明，在1997年9月以前协整方程还未出现结构变化，物价对外汇储备的弹性为-0.139，外汇储备与国内物价水平之间是负相关的关系，外汇储备每增加1%，不仅不会使物价上涨，反而会促使物价降低0.139%。这与理论推导两者之间同向关系的结论相悖，可能因为，一方面是1997年7月源于泰国的亚洲金融危机中，中国坚持人民币汇率稳定，不贬值，对进出口贸易和引进外资都受到了冲击，外汇储备也由前几年的快速增加，变为下降；另一方面，中国前一段时间实行的宏观经济政策也对物价的下降起着至关重要的作用。然而在1997年9月发生结构突变后，这一突变使得协整变量间的关系发生了显著的变化，物价对外汇储备的弹性开始由负向的-0.139变为正向0.015（-0.139+0.154）。这一结论支持了理论推导的结果，但尽管外汇储备对物价的影响为正，作用仍不是很明显，1%的外汇储备增加，物价将上升0.015%，究其原因可能是央行采取了冲销政策，央行会通过提高存款准备金率、发行央行票据、公开市场操作或者综合使用这几种工具去冲销过多的基础货币回收过多的流动性，这也说明央行采取的冲销政策在现阶段是有效可行的。3、人民币汇率、外汇储备与物价水平的关系。以上分别将汇率、外汇储备与物价水平之间的长期关系进行了分析发现，汇率与物价之间并不存在长期稳定的关系，而外汇储备对物价水平在长期内则存在单向的稳定关系。下面将汇率引入外汇储备对物价影响的模型，进一步考察两者共同对物价水平的影响效果，以考察三者间的长期稳定关系。三者GH检验的结果如下：表5汇率、外汇储备与物价水平之间的GH协整检验结果由表5可知，当将外汇储备、汇率共同作为解释变量时，GH检验表明外汇储备、汇率与物价水平三者之间不能存在任何形式的协整关系。这表明汇率与外汇储备、物价均不存在长期的稳定关系，且汇率的引入使得外汇储备与物价水平之间的长期稳定关系消失，这说明汇率的引入使得外汇储备与物价之间的关系变得更加复杂化。

结论与政策建议

突变范文篇8

1CSFR

CSF3R基因定位于染色体1p34．3，含有17个外显子，编码813个氨基酸的集落刺激因子跨膜受体，为粒细胞提供增殖和生存信号，并有助于其分化和功能。CSF3R是一单链细胞表面受体，属于细胞因子受体Ⅰ型超家族，其胞质部分包括有不同的功能区，即近膜区域有丝分裂信号传导，行使增殖功能；远端区域羧基末端与成熟信号传导有关，行使分化和增殖调节功能［3］。CSF3R与其配体G－CSF结合后，通过经典的下游途径，包括JAK－STAT，SRC家族激酶（尤其是LYN），非受体酪氨酸激酶SYK、Ras／Raf／MAP激酶和PI3K／Akt通路发挥作用，诱导中性粒细胞分化、增殖、存活，并刺激中性粒细胞功能。研究证明CSF3和CSF3R在粒细胞生成过程起着非常重要作用，小鼠缺乏CSF和CSF3R基因缺陷可表现严重的粒细胞缺乏。在严重先天性粒细胞缺乏患者，除了明确的遗传性致病基因（如ELANE或HAX1）突变外，有报道40％可伴有获得性造血干细胞CSF3R胞质远端羧基末端过早截断的基因无义突变，通过与其它癌基因共同作用延长细胞生存，增加克隆优势，被认为与高急性白血病转化相关［4－5］。另外，CSF3R基因胚系突变尚可导致显性遗传的先天性中性粒细胞增多或家族性慢性中性粒细胞白血病［6－7］，偶尔在急性髓系白血病也报道检出这种类似突变。

2CSF3R突变与CNL诊断

为了查找潜在的分子发病原因，2013年Max－son等［1］采用原代细胞深度测序结合酪氨酸激酶特异的小干扰RNA或小分子激酶抑制剂作用的方法，对传统临床诊断的CNL和不典型慢性髓系白血病（aCML）进行研究，27例患者中16例（59％）检出CSF3R突变，其中9例CNL患者中8例（89％）检出CSF3R突变，均涉及位于外显子14的胞外近膜结构域点突变，7例（78％）为CSF3RT618I突变，1例为CSF3RT615A突变。这些近膜结构域点突变单独发生更为多见，少部分与另一类导致CSF3R胞质尾部过早截断的移码突变或无义突变共同存在，形成复合突变。胞外近膜结构域点突变和胞质尾部过早截断突变两种类型突变分别通过下游JAK－STAT通路和SRC酪氨酸激酶通路介导，均具有体外转化能力，并相应地对激酶抑制剂芦可替尼和达沙替尼呈现不同敏感性。以CSF3RT618I表达的造血细胞进行移植，小鼠发生致死性的MPN，表现为突出的成熟粒细胞增多、骨髓明显活跃和肝脾成熟粒细胞浸润［8］。Pardanani等［9］在按照严格WHO标准诊断的12例CNL患者中更是100％检出CSF3R基因突变，10例为CSF3RT618I突变；而aCML、浆细胞病相关CNL、原发性骨髓纤维化症（PMF）和慢性粒－单细胞白血病（CMML）患者无一例检出该突变。这些均表明CSF3R突变在CNL非常常见，是CNL一致性的生物学特征；CSF3RT618I是CNL敏感而特异的分子标志，应纳入CNL诊断标准。2016年修订的WHOCNL诊断标准将CSF3RT618I和其他激活突变纳入诊断［2］，即：①外周血白细胞计数≥25×109／L，分叶核＋带状核中性粒细胞≥80％，前体中性粒细胞（早幼、中幼和晚幼粒细胞）＜10％，原粒细胞少见，单核细胞＜1×109／L，无粒系形态发育异常；②骨髓增生活跃，中性粒细胞比例及数量增多，中性粒细胞形态正常，原粒细胞占有核细胞比例＜5％；③不符合WHO定义的BCR－ABL1阳性慢性粒细胞白血病（CML）、真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET），或原发性骨髓纤维化（PMF）；④无PDGFRA、PDGFRB或FGFR1基因重排，无PCM1－JAK2融合基因；⑤CSF3RT618I或其他活化CSF3R基因突变，或持续性（≥3个月）的中性粒细胞增多、脾肿大，且没有可识别原因的反应性中性粒细胞增多，包括无浆细胞肿瘤，或者如果存在浆细胞病，须有髓系细胞细胞遗传学或分子学研究证实的克隆性证据。

3继发性或反应性粒细胞增多的排除更为方便

临床上中性粒细胞增多可见于多种良恶性疾病，精确诊断CNL需要仔细与这些具有类似表现的疾病进行鉴别。CML、aCML、CMML以及MPN／MDS等各自均具有特征性分子和细胞形态学特征，诊断也在2016年WHO髓系肿瘤分类中明确界定，与CNL鉴别并不困难。类白血病反应与CNL均可表现有外周血白细胞增多、骨髓增生明显活跃、BCR／ABL融合基因阴性和正常染色体核型，二者的鉴别极具挑战性。尽管仔细地病史询问、临床检查和外周血分析大多可以提供相应诊断线索，但若能证明存在克隆性造血，包括识别出CSF3R突变或其它分子或细胞遗传学异常，则更加支持CNL的诊断。而缺乏CSF3R基因突变虽并不能完全排除CNL诊断的可能性，但此时要诊断CNL更需格外谨慎。CNL经常同时伴发浆细胞病，以多发性骨髓瘤最为常见，意义未定单克隆γ球蛋白血症次之，文献报道可高达32％［10］。鉴于肿瘤性浆细胞可合成G－CSF，CNL能自发缓解，基础浆细胞病治疗中性粒细胞计数改善，患者预期寿命更长，尤其均不能检出特征性的CSF3R基因突变，表明伴发浆细胞病的“CNL”与单纯CNL是两种病因和机制不同的病理异常，支持前者实为浆细胞病继发的中性粒细胞增多［11－12］。另外，某些实体瘤也可易位生成G－CSF，导致副瘤性白细胞增多［13－14］，表现与CNL相似，需注意鉴别。

4CSF3R突变类型与CNL临床表现及预后

CNL有两种不同的CSF3R突变类型，一是常见的近膜端突变，主要包括T618I和T615A点突变。膜近端突变阻止CSF3R的O－糖基化，导致活性二聚体构型增加，配体非依赖的受体激活，以及经由JAK2的构成性下游信号传导［15］。已经证明最常见的CSF3RT618I突变经由JAK－STAT途径发挥作用，对JAK抑制剂芦可替尼治疗敏感。另一种是移码突变或无义突变，导致CSF3R的胞质尾端过早截断（D771fs、S783fs、Y752X和W791Z）［1，5］。受体的截断致使负调控基序丧失，包括与受体内化有关的双亮氨酸分选基序，以及靶向并进而降解受体的细胞因子信号传导3（SOCS3）的抑制剂结合位点［16－17］，破坏受体转运，延迟受体内化和（或）降解，导致细胞表面CSF3R表达增加，STAT5持续活化，细胞增殖加强［18］。单独的CSF3R的胞质尾端截断突变可能不足以驱动白血病发生，在CNL也极为罕见，对SRC激酶抑制剂达沙替尼治疗敏感［19］。绝大多数CNL呈CSF3R基因近膜端突变，最高约30％的患者同时表达近膜端突变和胞质尾端截断突变的复合突变。CSF3R基因复合突变可诱导小鼠发生侵袭性致死性白血病，并在体外显示对JAK和SRC抑制剂均耐药，而对MAPK信号传导途径抑制剂trametinib更为敏感［20］。最近，Szuber等［21］将19例CSF3R基因突变CNL患者按照突变类型分组为14例T618I突变和5例其它CSF3R基因突变（包括M696T突变2例，T640N突变，c．2215C＞T截断突变和I598ISYN突变各1例），比较2组患者的临床特征。结果显示，CSF3RT618I突变患者具有更多的不良临床和实验室特征，倾向于诊断时年龄更大，白细胞计数更高、血红蛋白和血小板计数值更低，以及异常核型发生率更高。这些不良特征最终转化为较其它CSF3R突变类型患者显著降低的整体生存（OS）。

5CNL其它突变基因

突变范文篇9

【关键词】X-连锁无丙种球蛋白血症（XLA）；Burton酪氨酸激酶（BTK）；诊断；治疗

【Abstract】X-linkedagammaglobulinemia（XLA）belongstotheprimaryimmunodeficiencydisease（PID），whichcallsBrutondisease.Recently，itcannotgenerateimmuneglobulin，becauseofthemutationoftheBruton’sagammaglobulinemiatyrosinekinase（BTK）gene，whichleadstodevelopmentaldisorderoftheBcell.Thisarticlereviewsthegeneticcharacters，mutationanalysis，molecularpathogenicmechanismandtherapyoftheBKTgene.

【Keywords】XLA；BTK；diagnosis；therapy

X连锁无丙种球蛋白血症（X-linkedagammaglobulinemia，XLA），又称Bruton无丙种球蛋白血症，是最早发现的人类原发性免疫缺陷病（primaryimmunodeficiencydisease，PID）之一，Bruton（1952年）首次报道。患者临床上以反复细菌感染为特征，血清中各类免疫球蛋白明显降低或缺乏，对抗原刺激不能产生抗体应答，血循环中B淋巴细胞减少，淋巴结及淋巴组织缺乏生发中心和淋巴滤泡，骨髓中无浆细胞，但前B淋巴细胞数量正常，T淋巴细胞数量及功能正常。典型病例为出生后半年左右开始反复化脓感染（如肺炎链球菌或嗜血流感杆菌）或迟至幼年发病，患者体内缺少成熟B细胞，基本上不能自主产生免疫球蛋白，必须依靠免疫替代疗法维持体液免疫水平。该病严重危害患者健康，危及患者生命。80%～90%［1］临床诊断病例可检出相关致病基因BTK发生突变，而其他10%～20%［1］的病人存在其他问题，有研究显示常染色体编码Igφ［2，3］、μHC［4］和LC的基因存在突变。

1BTK的遗传学特性大多数PID的遗传形式已经明确，几乎均为单基因遗传，多数为常染色体隐性遗传，其次为X连锁隐性和常染色体显性遗传。大多数情况男性发病，女性携带，但也有男性携带者不发病的报道。60%的PID突变基因的DNA序列已被克隆，突变位点（包括突变基因定位的染色体节段和基因位点）和突变形式（单个核苷酸缺失、替代、插入、移码突变、无义或错义突变等）也已确定［5］。在WHOPID专家委员会的指导下，成立了有关疾病基因库，记录登记全球范围的PID基因突变及其类型。多基因遗传性PID的确定较困难，至今尚无确切的报道。

1.1BTK的蛋白结构BTK蛋白为B细胞信号传递系统中的重要蛋白，属于非受体型蛋白酪氨酸激酶Tec家族的一员，该家族的成员还包括TEC、ITK/TSK/EMT和BMX。Tec家族蛋白酪氨酸激酶包括5个不同的结构区段（见图1），从N末端起为PH（pleckstrinhomology；PH）段，约有120个氨基酸，TH（Techomology；TH）段约有60～80个氨基酸SH3（Srchomology3;SH3）段约有60个氨基酸，SH2段约100个氨基酸，激酶催化段约280个氨基酸［6］。

图1BTK蛋白的组成（从N端开始）包括5个区域：PH、TH、SH3、SH2和激酶区。

注：图上边的数字代表各段的氨基酸长度，图下边的数字代表不同的外显子及其相应的位置。

BTK蛋白的空间结构多数已测明，包括PH区、TH区的前半部、SH3区和激酶催化区［7］，SH2区的结构可借用其他蛋白激酶的类似结构进行研究。这些三维空间结构可用于分析突变造成的蛋白空间结构的改变。

1.2BTK基因的分子结构及其突变分析在20世纪80年代，多位学者应用DNA多态性标志分析的方法，成功地将XLA的缺陷基因定位于X染色体中部（Xq21.3-22）的2cm区域内［8］。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病变基因区内分离鉴定了一个新的基因，该基因表达于正常人各期B淋巴细胞，在XLA患者中发生突变，故认为是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK基因全长37.5kb，含有19个外显子，除第一外显子外，其余18个编码BTK蛋白的659个氨基酸，分子量为76KD［9］。cDNA含有2560个核苷酸，有一个编码659个氨基酸多肽的开放阅读框架，起始密码子在核苷酸第133位置上，在起始位置上游的15个密码子处阅读框架闭合。根据国际研究小组BTK突变分析，迄今已经在471个家族544个XLA病人中发现了BTK基因341个独立存在的碱基置换、插入或缺失，其中有13个大段缺失和2个大段插入。突变不仅存在于19个外显子，还涉及内含子和启动区域。其中，发生频率最高的是错义突变，其次是无义突变和拼接位点突变。错义突变主要发生在三联体密码子的前两位。外显子8和9的185~287位没有错义突变，这些位点可能不易突变或是功能上不重要。33%的替代累及CPG双核苷酸，这是目前认为的最常见的突变热点［10］，而突变高频位点R520也属于CPG突变［6］。编码外显子蛋白突变的区域［11］（见表1）。表1编码外显子蛋白突变的区域

2BTK的分子致病机制BTK属于非受体酪氨酸蛋白激酶，该类激酶广泛参与细胞信号传导，影响细胞的存活、增殖和分化，BTK是B细胞发育成熟的关键因素。正常人除T细胞和浆细胞外均有BTK表达，而BTK基因突变只影响B细胞的数量，这说明BTK在B细胞的生长发育过程中起着至关重要的作用。目前对BTK参与细胞信号传导研究比较清楚的是BCR交联介导的信号传导途径。其过程简述如下：BCR交联激活Pl-3激酶并产生一定数量的Pl-3，4，5-risphosphate与膜结合，Pl-3，4，5-risphosphate与BTK的SH3段作用使其定位于细胞膜。然后，BTK经过两步活化：首先BTK激酶段Y551位磷酸化（很可能是与Lyn作用），接着是SH3段Y223位的自身磷酸化。活化后的BTK与B细胞衔接蛋白（BLNK）结合并激活phospholipaseC-γy（PLC-γ），导致钙离子通道打开，胞外钙离子内流。该信号传导途径最终导致细胞增生加强和转录的变化。此模式仅限于以B细胞受体交联作为刺激信号，至于前B细胞受体交联是否也引起相同的信号传导目前还缺乏证据［1，12］。该信号传导途径受FcRⅡB和SHIP（SH2-containinginositol-5-phosphatase）磷酸酶介导的另一途径制约，通过水解Pl-3，4，5-risphosphate和Ins（1，3，4，5）-etraphosphate关闭钙离子内流通道［13］。BTK不仅可以由BCR和FCR介导激活，也可以通过其他很多受体激活，包括G-protein-coupledreceptors（GPCR）、IL-3、IL-5和IL-6，另外，CD19和单克隆抗体的交联也可激活BTK［13］，近年来研究表明，CD40也是B细胞发育过程中的重要受体，传递刺激信号影响细胞存活、生长和分化。与BCR介导的BTK活化途径相似，CD40的交联也可激活BTK。CD40和BCR可能是B细胞发育过程中不同阶段激活BTK的信号传递通路。但也有研究提示CD40不通过BTK也可提高NFKB和JNK的水平，是独立于BTK的信号传导通路［14～16］。BTK在细胞内与很多分子相互作用，共同构成了一种微环境，在信号传导的过程中起着重要的作用。这些分子分别与BTK的不同区段相互作用，其中与PH段作用的分子研究得很多，R28附近区域与PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas作用。PH-TH区域与Gαq和Gβ双体作用;SH3与c-Cb1、WASp、Vav和sab作用;SH2与磷酸化的BLNK作用。另外，SH3与TH在BTK分子内作用，抑制BTK的活性。在BCR交联介导的信号传导途径中，Syk和BLNK对BTK的活化起正向调节作用，磷酸化的PKCs、sab和IBTK对BTK的活化有抑制作用。尽管与BTK作用的分子很多，但是它们如何协调地与BTK作用，完成BTK参与的信号传导，机制目前尚不清楚［17，18］。

3XLA的诊断XLA是一种原发性体液免疫缺陷症，危害着人们的健康。因而，对该症进行产前诊断和女性携带者的鉴定就显得十分重要［19］。为了研究XLA家系女性成员的情况，Fearon等采用了X染色体失活的方法去发现携带状况以及验证B淋巴细胞发育的内在缺陷。根据这一方法用重组DNA探针同时发现RFLP和X染色体基因甲基化。在无携带状态的女性的外周血粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞中发现X染色体的随机失活。相反，该症的三个携带者在外周B淋巴细胞两个X染色体中的一个优先失活，但不是T细胞或粒细胞。这一发现强烈地支持XLA是由B淋巴细胞发育的内在缺陷所致的假设。Lovering（1994）等［20］对BTK基因缺失患者DNA分子斑点杂交分析见到了已改变的DNA限制性片段，并对7个患者家庭用已经改变的限制性片段方法对与患者有关的女性携带状况作出诊断。随后，Schuster等［21］报道了对所有19个外显子。包括侧翼内含子边界采用PCR-SSCP方法成功地检测到两例男性患儿BTK的SH2功能区的新突变，并用一个已改变过的第一个引物做PCR扩增突变发生，作出三代中健康女性携带者的鉴定。接着，Hagemann等［22］对一个散发的XLA患儿及家庭的三代成员应用PCR扩增基因组DNA，采用序列分析的方法直接鉴定XLA的基因突变，结果诊断出患儿及其免疫学表现正常的女性携带者。以上这些方法均可应用于产前诊断。这无疑对优生优育是很有意义的。

4XLA的治疗研究免疫重建是采用正常细胞或基因片段植入患儿体内，使之发挥功能，以持久地纠正缺陷的基因及其表达产物。1968年使用HLA配型同种异体骨髓移植治疗2例致死性免疫缺陷病获得成功。至今已有近2000例PID患儿接受骨髓移植，总存活率为62%，其中同型合子骨髓移植达79%。无关供体配型骨髓（matchedunrelatedmarrowdonor，MUD）移植在近年已很盛行，成功率约为50%，5岁以内接受移植者可达85%［23］。近年开展脐血干细胞移植，存活率为75%。用母体骨髓CD34+干细胞宫内移植（腹腔注射）已有成功的报道［5］。将正常目的基因片段整合到患儿干细胞基因组内（基因转化），随细胞有丝分裂，转化的基因片段能在患儿体内复制而持续存在。理论上讲，凡能通过骨髓移植治愈的疾病均是基因治疗的指针［24］。基因治疗PID的尝试已经历多年，取得一定成效，但尚处于探索和临床验证阶段［25］。Faust等［26］的动物实验是通过免疫球蛋白的增强子和驱动子介导的小鼠BTKcDNA转录至两组免疫缺陷鼠（XLD或BTK-/-鼠）。转入1个拷贝的XLD或BTK-/-鼠经蛋白印迹法检测其BTK达到正常量的25%；而转录2个拷贝者其BTK达到正常量的50%。两组小鼠经检测均有正常数量的脾B细胞，两组小鼠对TNP一蔗聚糖刺激所产生抗体的反应和血清IgM、lgG3水平较正常野生鼠明显减低，但较XID小鼠有所提高。Drabek等［27］通过人类BTKcDNA与鼠主要组织相容性复合体Ⅱ区调节因子的转基因治疗，纠正了BTK缺陷鼠的B细胞功能，并发现转入的基因并不表达于前B细胞以前的分化阶段，此外它在胸腺上皮细胞、活化T细胞、单核细胞上表达，并在其他组织均有低水平表达。经蛋白印迹法检测转基因鼠的脾细胞产物发现，BTK蛋白总含量可达到与野生型鼠相同。这些研究均向我们提供了基因治疗XLA的可能性。此外，Rohrer等［28］通过动物实验证实，应用极少量正常骨髓细胞输注即可通过竞争使XID小鼠获得B系统免疫重建。这项研究推测，即使不成功的基因治疗也可对XLA患者有益，为今后开展人类XLA的基因、细胞治疗提供有利的基础和广阔的前景。总体上说，尽管目前基因治疗离成熟的临床治疗技术还有相当的距离，但经过近10年的临床试验，人们已获得了大量宝贵的临床资料。我们有理由相信，XLA的基因治疗将在不久的将来获得突破性进展。

5展望尽管80%～90%临床诊断为XLA的病人依靠BTK突变检测确诊为XLA，但是XLA的基因突变位点很多，与临床症状的相关性不强，同一家系中的XLA病人临床表现程度很可能各不相同。即：基因型和临床表型的关系是目前需要研究的课题之一［29］。这涉及到突变基因产物蛋白质的功能、结构稳定性和二维构像［30，31］。这样，通过基因突变及其对蛋白的影响无法预知XLA的病程、复杂程度、B细胞数量和免疫球蛋白的水平。只有彻底明确BTK在B细胞信号传导中的作用机制，才能找到基因突变和临床症状的相关性，完善XLA的基因诊断，并为治疗奠定理论基础［32］。1994年，国际上成立了BTK基因突变分析小组并建立了BTK基因突变数据库（http：//www.uta.fi/imt/bioinfo/btkbase/），为XLA的基因诊断提供了便利的条件。但是数据库中的病源主要来自西方国家、日本和俄罗斯，而国内的BTK基因研究相对处于空白阶段。因此，目前开展BTK基因突变的检测工作应成为国内同类研究的重点，通过建立有效可靠的BTK基因突变筛查方法，研究中国人BTK基因突变的规律。因此，随着对PID认识的深入和检测方法的简化，将会有更多的病例被确诊，不仅可以用常规方法治疗，而且可以做基因分析，同时，建立PID登记网络［33］，也将有助于了解确切的发病率和需要治疗的患者。总之，来自突变基因的BTK蛋白还没有被完全认识，在蛋白质水平这些突变的结果还不清楚。BTK基因突变在XLA发病机制中更详细作用还不清楚，但作为疾病基因，对其基因组结构的研究，将为未来的体细胞基因治疗创造条件。当然，体细胞治疗存在着一定的问题，目前还不能达到此目的，但这是今后研究的一个重要方向，基因治疗无疑是近20年来分子生物学和重组DNA技术迅速发展的一种结果。由于体内大剂量静脉丙种球蛋白的长期替代疗法有不少的副作用，且价格昂贵，不能根本解决问题。若能将缺陷的基因进行原位的修补，基因治疗将是最理想的根治方法。

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突变范文篇10