抗原范文10篇

抗原范文篇1

【关键词】mPEG修饰红细胞；Rh抗原；红细胞

RhAntigenStabilityofmPEGModifiedRedBloodCells

AbstractTheobjectiveofstudywastoinvestigatetheRhantigenstabilityofmPEG-modifiedRBC.RBCmembraneproteinSDS-PAGEtechnologywasusedtoanalyzethecombinationofthemPEGmodifiedRBCmembraneproteinwithmPEGmolecules;theRBCghostcoagulationtestand4℃CPD-preservedmodifiedRBCmixedwithmatchedbloodwereusedtoobservethestabilityofRBCRhantigencamouflagedbymPEG.TheresultsshowedthatthebloodgroupsofstoredmPEG-modifiedRBCwerekeptconsistencybeforeoraftersimulatingtransfusion,i.e.mixtureofmodifiedRBCwithmatchedbloods,whiletheplasmahemoglobinaftersimulatingtransfusionwasnotonlywithinthenormalrangeduringthestorage,butalsolessthanthatbeforesimulatingtransfusionevenafterincubationat37℃.TheelectrophoresispatternstainedwithiodineandCoomassiebluedisplayedthebandsofmPEGcombinedwithRBCmemberaneproteinandtheslowmobilityofmembraneprotein.ThehemagglutinationofPEGylationRBCghostsdidnottakeplaceandmPEGstillcoveredtheantigen.Inconclusion,mPEG-SPAcanbindtheerythrocytewithitsextractedmembraneproteininbothghostsandlivingerythrocytes.

KeywordsmPEGmodifiedredbloodcell;Rhantigen;redbloodcell

mPEG-SPA可以与蛋白质和多肽中的赖氨酸（K）、精氨酸(R)的胺基、组氨酸(H)的咪唑基以及酪氨酸(Y)的羟基发生化学反应，形成共价结合键，从而结合到蛋白质多肽上［1］，达到遮蔽抗原的作用。mPEG与红细胞膜Rh抗原结合后是否稳定，进入人体后是否会脱落，这些问题关系到修饰后红细胞进入人体后的安全性。为此，我们采用mPEG修饰的红细胞膜蛋白SDS-PAGE电泳、红细胞血影凝集实验以及用4℃CPD保养液保存的修饰红细胞与匹配血液进行的体外混血实验，对mPEG修饰后红细胞Rh抗原被遮蔽的稳定性进行了初步的研究。

材料和方法

样品

20mmol/LmPEG-SPA修饰的AB、RhDEeCc红细胞，AB、RhD-全血，RhD血液血浆。

试剂

CPD保养液、低渗磷酸缓冲液（20mOSM，pH7.4）、10mmol/LTris-盐酸低渗缓冲液、等渗液、电泳缓冲液、30%聚丙烯酰胺凝胶溶液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%分离胶、10%基层胶、0.25%考马斯亮蓝R-250、脱色液、样品处理液、蛋白分子量标准物（marker）。

仪器

倒置显微镜、KUBOTA2100离心机（Japan）、EBA12RZentrifugen低温高速离心机（Beckman公司产品，Germany）、XMTB数显调节仪水浴锅（浙江余姚工业仪表二厂产品）、Mini-ProteanⅡ型电泳仪（Bio-Rad公司产品，USA）、TS-1型脱色摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司产品）。

mPEG修饰红细胞体外稳定性检测

将CPD保存的血比容为35%的20mmol/LmPEG-SPA修饰的ABRhDEeCc红细胞、ABRhD-全血、RhD血浆分装，于2-6℃保存并在储存第1、7、14、21天时取CPD保存的修饰的ABRhDEeCc红细胞50μl，用间接抗人球蛋白试验鉴定血型后，分别加入250μl的ABRhD-全血和RhD血浆，以CPD保存的血比容为35%的20mmol/LmPEG-SPA修饰的ABRhDEeCc红细胞RhD-全血和RhD血浆作为对照，在37℃摇动孵育24小时后，再次检测血型和血浆游离血红蛋白。

mPEG修饰的红细胞血影凝集实验

取未修饰和修饰的红细胞各40μl，加10倍体积的PBS（pH7.4），4℃放置30分钟，3500×g/min离心10分钟，弃上清，加入600μl的低渗磷酸缓冲液，4℃放置30分钟，3500×g/min离心10分钟，弃上清，低渗磷酸缓冲液洗涤4次，3500×g/min离心10分钟，沉淀即为血影细胞。在血影细胞加入Rhanti-D多抗后，在倒置显微镜下观察结果。

mPEG修饰的红细胞膜蛋白的SDS-PAGE分析

红细胞膜蛋白的提取取CPD抗凝血100μl，以2000×g/min10℃离心5分钟，除去血浆和灰白色血细胞层；另取mPEG-SPA修饰红细胞约40μl，加预冷的等渗液将沉淀RBC悬浮，以2000×g/min10℃离心5分钟，除去上清液，如此重复洗涤3遍；按1∶10（v/v）向沉淀RBC中加入预冷的低渗液，混匀后4℃放置至红细胞完全溶血；以1000×g/min，4℃离心10分钟，除去上清液，将沉淀在4℃用低渗液6000×g/min离心5分钟，洗涤3次，获得白色的RBC膜样品。

电泳分别配制10%分离胶和基层胶，灌分离胶，37℃放置40分钟，待胶凝固，灌基层胶，放梳子组装电泳装置；将蛋白marker及取得的RBC膜样品各10μl与5×样品缓冲液在Eppendorf管中混合；95℃加热5分钟，将蛋白变性；用微量加样枪将样品加入样品孔底部；180V恒压电泳至溴酚蓝指示剂移动至电泳胶外。

PEG碘染色［2］将电泳后的胶放入容器内，在摇床上缓慢振荡的过程中加入20ml0.1mol/L的高氯酸，15分钟后依次加入5ml5%氯化钡，2ml0.1mol/L碘溶液。5分钟后见到碘染的PEG条带逐渐出现，拍照、记录结果。

考马斯亮蓝染色将碘染的胶放在蒸馏水中漂洗约20分钟，碘染条带逐渐消失；将约20ml考马斯亮蓝染液放入盛胶的容器里，摇床缓慢振荡约2小时，将染液弃去，再在水中漂洗数次，然后加入脱色液，脱色的条带清晰，背景变浅，其中更换脱色液数次，拍照、记录结果。

统计学处理

采用SPSS10.0软件对检测结果进行Chi-square检验。

结果

mPEG修饰红细胞体外稳定性

修饰的ABRhDEeCc红细胞在储存过程中和模拟输血过程（即与全血和血浆混合后于37℃孵育24小时）,Rh血型D、E、e、Ch和c抗原未发生变化，mPEG修饰红细胞在保存过程中血浆游离血红蛋白水平正常，修饰的ABRhDEeCc红细胞在模拟输血过程后，游离血红蛋白未见升高，反而降低，且1组和6组在统计学有显著差异，1组和7组在统计学同样有显著差异（附表）。Table.Plasmafreehemoglobinchangeintheprocessofbloodmixture（略）

mPEG修饰的红细胞血影凝集

mPEG-SPA修饰前后的红细胞处理得到的血影和IgGMRhD多克隆抗体，用直接凝集实验进行鉴定，结果表明mPEG修饰前的红细胞发生了凝集，而mPEG-SPA修饰后的红细胞未发生凝集（图1）。

mPEG修饰的红细胞膜蛋白的SDS-PAGE电泳分析

红细胞膜蛋白经SDS-PAGE碘和钡染色后，未修饰红细胞膜蛋白和蛋白marker均未出现，只有2.0mmol/LmPEG-SPA修饰的红细胞膜蛋白出现条带，主要是血影蛋白、条带3，条带4.1和4.2及血型糖蛋白（图2）；红细胞膜蛋白经SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后，蛋白marker、2.0mmol/LmPEG-SPA修饰的、未修饰的红细胞膜蛋白均出现条带；未修饰的红细胞膜条带3、条带4.1、条带4.2、肌动蛋白和血型糖蛋白条带的迁移速度均快于修饰的红细胞膜蛋白条带（图3）。

讨论

mPEG与红细胞膜只有稳定结合，才能保证其输入人体后不脱落，被修饰的抗原不会暴露，因而不会导致机体产生免疫应答反应。在对重组蛋白、酶、药物等的应用和研究基础上发现，PEG与蛋白分子共价结合后会进一步吸附水分子，使蛋白分子具有一个PEG和水分子包裹亲水外壳，这个外壳能有效地遮蔽蛋白质表面的抗原［3］。已有研究结果显示，Rh血型抗原膜外的1、2、3、4、5环上均存在与mPEG-SPA发生反应的氨基酸K、R、H和Y，后者是mPEG共价结合蛋白质氨基酸物质基础。因此，从理论上讲结合应是稳定的。由于目前缺乏成熟的修饰红细胞动物评价模型［4］，因此我们设计了mPEG修饰红细胞体外稳定性实验，结果表明：不同保存时间的mPEG修饰的红细胞在模拟输血即混血前后的血型保持不变，这一结果不仅支持修饰的红细胞血型在体外不变，而且也提示其进入体内应是稳定的；同时mPEG修饰的红细胞在保存过程中游离血红蛋白水平正常，并且混血后经37℃孵育的mPEG修饰的红细胞游离血红蛋白水平低于不混合的修饰红细胞，这不仅说明mPEG与红细胞的结合是稳固的，同时表明全血和血浆与保存期间的mPEG修饰红细胞混合，不仅不会导致红细胞结构和功能损伤，而且有利于mPEG修饰红细胞功能维持和恢复，mPEG仍稳固与红细胞结合起着遮蔽抗原的作用。已知，SDS-PAGE电泳分析可以显示红细胞膜上分子量从15000-250000的15种主要蛋白，包括血影蛋白（spectrin，MW：240000；220000）、锚蛋白（ankyrin）、条带3(MW：100000)、条带4.1、条带4.2、肌动蛋白（actin）和血型糖蛋白(glycophorin，MW:30000）［5］。

Scott等［6］研究结果表明，与mPEG结合的膜蛋白会由于分子量的改变使电泳的带型发生变化，并且表现出剂量依赖性；而且已有的结果也表明，mPEG可以与红细胞膜蛋白血影蛋白、条带3、条带4.1、条带4.2、肌动蛋白和血型糖蛋白结合［7］。本研究中对保存期21天mPEG-SPA修饰的红细胞膜蛋白经SDS-PAGE电泳后，先用碘染色，脱色后再用考马斯亮蓝染色，比较分析PEG特异的碘染和考马斯亮蓝染色显色图谱，发现特殊的碘染色可以显示出mPEG与红细胞膜蛋白结合的条带，mPEG-SPA与红细胞膜蛋白结合后导致蛋白分子迁移速度发生改变。这一结果证实了mPEG-SPA即使在红细胞膜蛋白被单独提取后仍与与红细胞膜蛋白稳固结合的。依据血影仍保持有抗原性，且可与相应抗体结合产生凝集现象的原理，我们的mPEG修饰的红细胞血影凝集实验不仅证实了修饰红细胞在质膜裂损后血影抗原仍能与mPEG结合，而且mPEG仍可有效地遮蔽抗原，使抗原不与相应抗体结合而不发生凝集现象，这一结果进一步证实mPEG-SPA与红细胞膜稳固结合。

【参考文献】

1Nektarcompany.PolyethyleneglycolandderivativesforadvancedPEGylation.MolEnginCatal,2003:1-19

2KurfurstMM.Detectionandmolecularweightdeterminationofpolyethyleneglycol-modifiedhirudinbystainingaftersodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis.AnalBiochem,1992;200:244-248

3AbuchowskiA,van-EsT,PalczukNC,etal.Alterationofimmunologicalpropertiesofbovineserumalbuminbycovalentattachmentofpolyethyleneglycol.JBiolChem,1977;252:3578-3581

4邱艳，檀英霞，李立立等.PEG修饰红细胞的动物实验.中国实验血液学杂志，2006;14:816-821

5汪堃仁.细胞生物学.北京：北京师范大学出版社.1988：61-63

抗原范文篇2

论文摘要：前S1抗原（Pre-S1Ag）检测是对乙肝“两对半”尤其是e抗原和HBV-DNA测定的重要补充和加强。前S1抗原酶免测定试剂盒经过在北京、四川、浙江、河南、深圳、海南等近百家医院与乙肝“两对半”检测联合应用后正式推向临床，充分显示了该试剂在病毒性乙型肝炎的临床诊断，指导治疗等方面的重要价值。笔者就前S1抗原检测谈谈自己的体会。

S、前S2和前S1是乙型肝炎病毒（HBV）的三种成分，含有前S1的蛋白主要存在于Dane颗粒和管型颗料上，前S1蛋白在病毒感染、装配、复制和刺激机体产生免疫反应以及在病毒侵入肝细胞等方面起着十分重要的作用。

1基因结构

乙肝病毒为嗜肝DNA病毒，约3200个氨基酸，由一个不完全双链DNA组成。长链L含4个开放读码框架，为病毒蛋白的编码区：S、C、P、X；短链S相当于长链的50%~100%，其不固定端可被内原性DNA多聚酶延长，使病毒成为完整的双链。HBV基因组编码HBV抗原，所有四个功能性读码框架位于DNA负链，P基因编码DNA聚合酶，C基因编码HbcAg，S基因编码S抗原，前S1抗原和前S2抗原，X基因编码X产物。编码不同形式的表面抗原（HBsAg）的HBV基因区域由大蛋白（LHBs），中蛋白（MHBs）和小蛋白（SHBs）组成，在第一和第二个起始密码子之间的序列称为Pres1，在第二和第三个之间为Pres2，从第三个密码子到终点密码子的序列为S。

2临床意义和用途

①反映HBV的感染与复制状况的指标：前S1抗原主要存在于血清中提示机体内含有HBV就有前S1抗原，它是一项十分重要的病毒复制指标，提示前S1抗原可作为HbeAg和HBV-DNA检测的补充和对照。抗HBeAb（+）慢性乙型肝炎和HBV慢性无症状携带者中，前S1抗原（+）可表示病毒的复制，提示临床上只检测“乙肝五项”是不够的，补充前S1抗原的测定十分重要。病毒附着于肝细胞上，最重要的介导部位是前S1蛋白的氨基酸（AA）21-47片段，变异的病毒只要这一区段完好就有传染性；②预后及药物疗效：前S1抗原阴转越早，预后越好，是病毒清除的最早迹象是急性乙型肝炎患者，慢性肝炎前S1抗原持续阳性。因病毒基因变异的HBeAb（+）慢性乙型肝炎病人，较易进展为肝硬化，甚至肝癌，前S1抗原检测是疾病预后的良好手段。前S1抗原可作为药物抗病毒疗效的指标，是对HBV-DNA和HBeAg指标的补充和加强；③乙型肝炎早期诊断：前S1抗原出现在急性乙型肝炎感染的最早期，在转氨酶升高前即可查出，提示可作为早期诊断乙肝病毒感染。在体检和献血员中加查前S1抗原，可起来疾病的早期诊断和尽早切断传染源的重要作用。

3常见问题

对于HBV的检测人们常常会产生一些问题，主要有三个方面：①检验两对半为何还要查Pre-S1？目前，乙型肝炎病毒血清学检测项目主要是HBV-M（即乙肝五项，包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb）。目的是诊断患者的感染状况，病毒复制情况，病程预后和药物疗效的观察等。前S1抗原的检测能够从以下几个方面弥补和加强乙肝五项检测的不足：一是前S1抗原出现在急性乙型肝炎感染的早期，在转氨酶升高前即可查出，提示可作为早期诊断乙肝病毒感染的指标；二是急性乙型肝炎患者前S1抗原阴转越早，预后越好，是病毒清除的最早迹象。反之，前S1抗原持续阳性，将发展至慢性肝炎；三是HBeAb（+）慢性乙型肝炎约占慢性乙肝的30%-50%，检测前S1抗原，提示病毒在机体内继续复制，此类患者更容易演变为肝硬化或肝癌。加查前S1抗原，弥补了因HBeAg缺失造成的诊断和治疗困难；四是在HBV无症状携带者中，有一定比例的HBeAb（+）者，加查前S1抗原（+）提示病毒在体内还较活跃，病毒并没有清除，肝脏还有潜在的病理损伤的可能；五是抗病毒治疗乙型肝炎，加查前S1抗原可作为治疗前的患者筛查和治疗后的疗效判断，尤其对HBeAb（+）的慢性肝炎患者抗病毒治疗的排查也起到重要作用。因此检验两对半，加查前S1抗原可在急性肝炎、慢性肝炎、HBV无症状携带者和抗病毒治疗乙型肝炎诊疗过程中起到十分重要的作用；②HbeAb（+）的HBV感染者中，为何要检查前S1抗原？慢性乙型肝炎患者，抗HBe阳转后，部分可演变为肝硬化或肝癌，自然好转率非常低；HBeAb（+）的HBV无症状携带者，往往是因为病毒基因变异所致，其所携带的HBV变异毒株大多数表现为在病毒基因组前C区末端突变，产生一个新的终止密码子（TAG），阻断了HBeAg的形成，导致在临床上出现HBeAg缺陷和HBV血清型。因HBeAg的缺失，造成诊断和治疗的困难，此时检测前S1抗原既能较为准确的检测病毒在机体内复制状况，又能诊断疾病的转归和了解是否携带HBV变异毒株，充分显示了前S1抗原的临床价值；③为什么检测HBV-DNA还要检测前S1抗原？一是前S1蛋白是乙型肝炎病毒（HBV）外膜蛋白的主要专长部分，在病毒感染机体的整个周期中，前S1蛋白的独特功能，使其能够较充分的反应机体的体液免疫状况，直至病程的转归过程，这是单一测定HBV-DNA所不能做到的；二是免疫测定技术因其有效、直接、简便的特点，已经在临床诊断应用上占主导地位。前S1抗原的检测与基因测定HBV-DNA在治疗方面能够相互补充和加强；三是HBVDNA-PCR技术要求精密、所需要的条件高，易发生污染和假阳性，不适于做常规检测，前S1抗原测定与之相互补充和加强。

4检测与操作

乙型肝炎病毒前S1抗原酶免诊断试剂盒采用ELISA双抗体夹心法，测定前S1抗原肽，最低检测浓度为0.1ug/L。检测原理采用双抗体夹心ELISA法，用抗-PreS1和抗HBs作为固相化抗体和酶标抗体。如果标本中存在乙肝病毒PreS1抗原，则形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应，适用于血浆和血清类标本。试剂盒组成：微孔板、阴性对照、阳性对照、酶结合物、显色液A、显色液B、终止液、洗涤液。

操作步骤第一步，反应孔内加入待测标本50uL，设阴、阳性对照各2孔，每孔加入阴、阳性对照各50uL，并设空白对照1孔，置37℃孵育30min；第二步洗板；第三步每孔加入酶结合物1滴或50uL（空白对照孔除外），置37℃孵育30min；第四步洗板，第五步加入显色液A、B各一滴，充分混匀后，置37℃孵育15min；第六步加入终止液、混匀；第七步酶标仪读数。

5判断及需要注意的问题

5.1判断标准

（1）所有阴性对照、阳性对照和标本的读数值减去空白对照读数即为计算值；

（2）阳性对照读数必须比阴性对照读数大0.300，实验结果成立；

（3）临界值（CUTOFF）=2.1，阴性对照平均OD值。测试标本的计算值大于或等于临界值为阳性；测试标本的计算值小于临界值为阴性。

5.2注意事项

（1）使用前试剂盒应预先在室温下平衡30min；

（2）试剂盒启用后应尽快用完；

（3）不同批次的试剂组份不能混用；

（4）使用本试剂盒应视为有传染性物质；

（5）温育反应板温度和时间必须严格控制；

（6）阳性对照仅用于判读试剂盒内的包被微孔板和酶是否有效，不是临界值的标志；

抗原范文篇3

关键词白细胞共同抗原5H12分子量

Identificationofleukocytecommonantigen(LCA)5H12anddiscoveryofitseffectonBcellactivation

WANGYun-Ping,ZHANGShu-Zhen,ZHULi-Ping.

DepartmentofImmunology,BinzhouMedicalCollege,Binzhou256603

AbstractObjective:Toidentifyleukocytecommonantigen(LCA)withmonoclonalantibody(McAb)andanalyzetheLCA.Methods:ImmunizedBalb/cmicewithBcellline3D5andobtainedMcAb5H12，thendetectedtheexpressionof5H12antigenonvariouskindsofleukocytesandwhitecelllinesbyindirectimmunofluorescenceandflowcytometricanalysisandfinallyisolatedandpurified5H12antigenfromcellmembraneandanalyzedthe5H12byproliferationtest,SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)andWestern-blotting.Results:5H12wasexpressedonapanelofhumanleukocytesandwhitecelllinesincludingrestingTcells,restingBcells,monocytes,neutrophils,PHA-activatedTcells,anti-μ-activatedBcells,Tcelllines(Jurkat,Peer),Bcelllines(3D5,Daudi,CESS,BJAB),binationof5H12antigenwith5H12McAbcouldinduceinhibitionofBcellactivationinadose-dependentmannerandthissuggestedthat5H12mightplayaroleintheprocessthatledtoBcellactivationandproliferation.SDS-PAGEandWestern-blottinganalysisindicatedthat5H12isa22kDone-peptide-chainprotein.Conclusion:5H12isaone-peptide-chainmembraneproteinmolecule,itisaLCAandrelatedtocellactivation.

KeywordsLeukocytecommonantigen5H12Molecularweight

白细胞共同抗原(leukocytecommonantigen,LCA)表达于多种白细胞表面，是一大类粘附分子，具有多种功能，与细胞活动密切相关。在免疫应答过程中，LCA参与免疫细胞间的粘附，充当协同刺激分子，与免疫细胞的识别活化、增殖分化、发挥效应有密切关系。LCA表达缺陷，可导致免疫反应异常。由于其作用重要，LCA已受到广泛重视。本实验鉴定了一种LCA5H12，并对其功能进行了初步分析，为深入研究打下基础。

1材料与方法

1.1仪器、材料与试剂541型流式细胞仪(美国Coulter)；CO2培养箱(美国Shel-Lab)；FITC标记的羊抗鼠IgG，碱酶标记的羊抗鼠IgG，DEAE-SephadexA50，anti-μ，PHA，SDS，过硫酸铵，HAT，TEMED(均为美国Sigma)；RPMI1640(美国GIBCO)；CNBr活化的Sepharose4B(瑞典Pharmacia)；3H-TdR(中国原子能研究所)；NP-40，PEG(瑞士Fluka)；硝酸纤维素膜(美国Bio-Rad)；其它均为国产试剂。各种细胞株由医科院基础所单抗室提供。

1.2单抗制备用人活化的B细胞株3D5免疫Balb/c小鼠。在50%PEG(MW：1450)条件下，将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。融合后的细胞在HAT培养液中培养，杂交瘤细胞经两步进行筛选。先用ELISA法筛选产生高滴度小鼠Ig的阳性孔。再用3D5细胞和人T细胞株Jurkat作靶细胞，经间接免疫荧光染色，用流式细胞仪进行分析，然后对与3D5和Jurkat两种细胞均呈阳性反应孔的细胞作连续3次克隆，最后得到杂交瘤细胞株5H12。接种5H12杂交瘤细胞于Balb/c小鼠腹腔以制备腹水。单克隆抗体5H12的血清型用双向琼脂扩散试验检测。

1.3人外周血单个核细胞(PBMNC)的制备方法见文献［1］。

1.4人外周血T细胞、B细胞、单核细胞、中性粒细胞和红细胞的分离方法见文献［1］。

1.5活化T、B细胞的制备用24孔板培养细胞，每孔加T细胞悬液2ml(含2×106个细胞)，T细胞悬液中加PHA至终浓度2μg/ml，B细胞悬液中加anti-μ至终浓度100μg/ml，5%CO2培养箱孵育72h。

1.6间接免疫荧光试验一抗用5H12单抗腹水。二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，用流式细胞仪检测［2］。

1.7流式细胞仪分析仪器的工作条件为488nm，每个样品均检测10000个细胞，检测参数为FALS，L90°LS和LIGFL，用仪器中的计算机分析阳性细胞百分率及荧光强度。

1.8T、B细胞增殖试验96孔尖底培养板，每孔置1×105个PBMNC，分加PHA(终浓度2μg/ml)，anti-μ(终浓度100μg/ml)和/或5H12单抗腹水(稀释度为1∶1000.0、1∶500.0、1∶250.0、1∶125.0、1∶62.5)，对照用SP2/0腹水，培养板置37℃、5%CO2培养箱孵育72h，孵育前16h加3H-TdR，用细胞收集器收集细胞，液闪计数cpm值，每一条件均设3个平行孔。

1.95H12单抗的纯化先用硫酸铵分级沉淀法，后用DEAE-SephadexA50离子交换法得到纯化的5H12单抗。

1.10膜蛋白的提取、纯化和鉴定按文献［3］提取3D5细胞膜蛋白，按文献［4］用亲和层析法从膜蛋白中纯化5H12抗原，亲和层析柱用的载体为CNBr活化的Sepharose4B，配基为5H12单抗，纯化抗原先经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再进行Western印迹分析，印迹分析时，一抗用1∶200稀释的5H12单抗腹水，对照为CD8单抗腹水，二抗为1∶3000稀释的碱酶标记的羊抗鼠IgG［5］。

2结果

2.1杂交瘤的筛选与克隆用3D5和Jurkat作靶细胞，用间接免疫荧光染色法对产生较多小鼠IgG的杂交瘤进行筛选。取两种细胞同时染色(5H12)的细胞，用有限稀释法经连续3次克隆，得5H12杂交瘤。把5H12杂交瘤注射入Balb/c小鼠腹腔制备5H12单抗腹水。琼脂扩散试验表明5H12单抗为IgG2b。

2.25H12抗原的表达间接免疫荧光染色后经流式细胞仪分析可见休止T细胞、休止B细胞、单核细胞均明显表达5H12抗原，而中性粒细胞弱表达，红细胞不表达，B细胞经anti-μ激活后及T细胞经PHA激活后，细胞表面仍表达5H12抗原。各种细胞株包括T细胞株(Jurkat,Peer)、B细胞株(3D5、Daudi、CESS、BJAB)、单核细胞株U937和髓样细胞株K562均表达5H12抗原。上述结果说明5H12抗原表达于多种白细胞表面，属白细胞共同抗原。

2.35H12抗原对人B细胞增殖的影响功能试验表明5H12单抗能够抑制anti-μ诱导的B细胞增殖。

表15H12单抗抑制anti-μ诱导的PBMNCs的3H-TdR掺入

Tab.1Inhibitionof3H-TdRuptakeofanti-μ-inducedPBMNCsbymonoclonalantibody5H12

3H-TdRuptake(cpm)

—1∶1000.01∶500.01∶250.01∶125.01∶62.5

—1)—5H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/0

EXP1.1501324118753631131729921114243689425037432041

±243±616±92±183±67±352±165±203±112±442±83±428

EXP2.116528232155267118852858184929721358278913102453

±167±403±391±264±442±50±379±361±110±67±327±537

EXP3.164934112570332223513508221043431748450714562928

±400±386±90±274±86±238±594±404±245±223±251±92

EXP4.1266249750344174103647546353965830927482968

±461±1333±318±2029±74±111±91±1106±135±1182±338±702

Note：1×105PBMNCsin0.2mlof10%FCSRPMI1640wereincubatedatthepresenceof100μg/mlofanti-μfor72h，variousconcentrationsofMcAb5H12orSP2/0wereappliedtothecellcultureatthe0h;1)Withoutanti-μ，EXP：experiment

anti-μ为B细胞丝裂原，对T细胞无作用，因此用anti-μ刺激PBMNC就是刺激B细胞增殖。4次实验表明，anti-μ诱导的B细胞增殖均受到5H12单抗的抑制，此抑制作用随5H12单抗浓度的升高而增强，但抑制作用因个体而异。对照SP2/0腹水则无此作用(表1)。5H12单抗对PHA诱导的T细胞增殖无影响，也不能诱导人PBMNC增殖。

2.45H12抗原的鉴定纯化的5H12抗原在还原和非还原条件下经SDS-PAGE，均只显示一条带，据标准曲线测得其分子量为22kD。Western印迹分析证明这条22kD的蛋白带就是5H12抗原。

3讨论

LCA表达于多种白细胞表面，对细胞发挥生理功能具有重要作用，目前已发现LCA60余种，作用极为广泛，有些LCA的作用已经清楚，而有些尚需探讨。本实验中，我们用制备的单抗鉴定了一种LCA5H12，具有调节B细胞活化的作用。5H12的分子量与已知的LCACD81分子量相同，均为22kD。CD81主要表达在B细胞表面，也表达在单核细胞及T细胞表面，属白细胞分化抗原4次跨膜分子家族(TM-4)成员，具有离子通道作用，但CD81为增殖性抗体的靶抗原，而实验中的5H12为抑制性抗体的靶抗原(对B细胞而言)。因此两者分子量虽然相同，但作用不同。但5H12与CD81的区别尚有待于对多肽链的进一步分析，包括氨基酸的组成、排列、二硫键的数目与位置以及羧基端与氨基端的氨基酸种类。至于T、B细胞5H12抗原与相应单抗结合后表现出不同效应、可能涉及多种因素，如T、B细胞活化的途径不同，表面抗原分布不同，受体与配体亲和力不同，活化途径不同，细胞基因功能活动情况不同等。但只有对5H12抗原进行深入的分子生物学研究，才能完整揭示其生理和病理功能。

张淑珍朱立平中国医学科学院基础医学研究所，北京100730

作者简介：王运平，男，34岁，硕士，讲师，主要从事BRM的研究；

朱立平，男，59岁，教授，博士生导师，主要从事分子免疫学研究

作者单位：（山东滨州医学院免疫学教研室，滨州256603)

4参考文献

1杨景山.血细胞的分离.见：杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物学技术.北京：北医协和联合出版社，1990：4-18

2王德斌，张叔人，刘卓如．细胞免疫学方法选编.北京：人民卫生出版社，1986：289-308

3HarlowE,LaneD.Antibodies：Alaboratorymanual.NewYork:Coldspringharborlaboratory,1988:446-450

抗原范文篇4

天疱疮是累及皮肤黏膜的一种自身免疫性大疱性疾病。目前已证实天疱疮是以患者体内出现针对自身表皮角质形成细胞上的桥粒芯糖蛋白（dcsnoglein,Dsg)的特异性抗体IgG，能与角质形成细胞结合产生棘层松解，导致临床上所见的松弛性水疱和大疱，其中Dsg1、Dsg3及其抗体在天疱疮中发挥极其重要的作用。本文就抗原抗体及其临床意义作一综述。

1抗原抗体

1.1抗原现已明确天疱疮抗原Dsg属于桥粒的跨膜成分,属粘附分子中的钙粘素超家族的成员,其基因位于18q12.1上。Dsg分为Dsg1、Dsg2、Dsg3三类，其中Dsg2表达于所有的桥粒组织中，Dsg1、Dsg3主要限于复层鳞状上皮。Dsg1分子量约160KD，主要分布于表皮上层的角质细胞膜上，以颗粒层和颗粒下层优势表达［1］，为落叶性天疱疮（PF）的靶抗原；Dsg3的分子量约为130KD，主要分布于表皮基底层，在基底层上层的角质形成细胞表面，是寻常性天疱疮（PV）的靶抗原。杨春俊等［2］在天疱疮抗原的定位研究中，用金标记包埋后采用免疫荧光技术，发现PF和PV的靶抗原在角质形成细胞间的部位相同，均位于桥粒复合体上。Dsg1及Dsg3分子同其他钙粘素分子一样具有5个串联重复、大小大致相等的胞外结构域（extracellulardomain,EC)，其中ECⅠ对应胞外氨基端残基，EC5位于羟基端。Dsg1及Dsg3的不同主要在于Dsg1的1～4胞外结构域具有同源性，Dsg3的5个胞外结构域均具有同源性。

天疱疮抗原的5个胞外结构域中，EC0、EC2、EC4之间具有相对较大的同源性，能被天疱疮患者的血浆特异性识别，因此，这些表位被称为“免疫优势表位”或“致病性表位”，特异性的识别该表位的抗体被称为“致病性抗体”，其中EC1-2及EC3-4具有抗原特异性，与天疱疮抗体具有高度的亲和力，从而为天疱疮的血清学诊断与鉴别提供了新的途径［3］。

1.2抗体天疱疮抗体（PAb)是天疱疮发病的关键因素。1964年Beumer等证实在天疱疮病人的血清中存在抗鳞状上皮的细胞间抗体，并且发现在天疱疮皮损的边缘有免疫球蛋白和补体沉积。最近，Amagai［4］用ELISA方法，通过重组Dsg1、Dsg3，发现天疱疮的临床表现是由患者体内抗桥粒芯蛋白自身抗体的类型所决定。且国内外多数研究认为寻常性天疱疮中天疱疮抗体IgG4是其发病中的重要致病性抗体亚类。国内李逾等［5］为研究天疱疮抗体（PAb）各亚类在致病中的作用，在培养的组织中加入纯化的天疱疮抗体IgG1～IgG4，免疫荧光检查发现IgG4的荧光最强，其次为IgG3、IgG1、IgG2，说明IgG4与抗原有较强的亲和力。而当各亚型浓度相同时，致培养表皮细胞棘层松解程度相同。另外，在培养的表皮细胞中加入天疱疮抗体继续培养24h，细胞的整体外观无明显变化，48～72h，细胞间隙渐增宽，细胞出现松解和小水疱。由此奠定了天疱疮抗体在天疱疮发病中的重要地位。

2抗原抗体的致病机制

Morioka等认为天疱疮患者发生棘层松解可能通过角质形成细胞释放蛋白酶，如纤溶酶原激活物，尤其是尿激酶型纤溶酶原激活剂（upA）破坏细胞间的粘附作用，天疱疮抗体与抗原的结合作为一信号，传递至细胞内部，角质形成细胞产生蛋白溶解酶，被激活的蛋白酶溶解细胞间粘着性连接结构和细胞粘附分子，使表皮细胞相互分离。McNeill等证实表皮角朊细胞表面有高亲和力的upA的受体［6］。而只有upA的受体结合upA才有活性。落叶性天疱疮抗体与上棘层细胞结合后，上棘层细胞分泌位于细胞膜上的upA，溶解细胞周围的粘附分子，引起上棘层的棘层松解；同样，寻常性天疱疮引起下棘层的棘层松解。角朊细胞还分泌纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）。PAI在调节PA功能方面起重要作用，另外PA产生于角朊细胞但不包含在溶酶体内，不会引起较为广泛的破坏。

近年来，钙离子在天疱疮发病机制中的作用受到许多学者的重视。Memar等［7］在实验中发现天疱疮抗原可能通过调节细胞内钙离子移动信号的改变诱导细胞内钙离子暂时性的增加，随之角质形成细胞释放蛋白酶，进一步诱导水疱形成，这种钙离子流可被天疱疮抗体的预吸附所抑制抗体。

3天疱疮抗体Pab的检测

免疫荧光已成为诊断天疱疮的常用方法。临床常用间接免疫荧光（IIF）和直接免疫荧光（DIF）。其最可靠的诊断依据是表皮细胞间IgG和C3的沉积。Helander等对未经选择的黏膜标本进行直接免疫荧光检查，发现直接免疫荧光对诊断天疮疱的价值优于组织病理。天疱疮活动期IIF检测血清Pab阳性率更高。IIF和DIF对照检查，发现DIF阳性率较IIF更高，且持续时间较长，因此确定诊断时宜选用DIF。且发现天疱疮活动期不同部位的“正常”皮肤DIF检测均为阳性，因而认为不一定在皮损边缘部位取材，但是皮损边缘皮肤荧光抗体稀释度较“正常”部位为高。另外，由于低滴度的天疱疮样抗体的存在，国外学者定天疱疮抗体滴度1：50以上为阳性，国内一般定为1：40以上。

Wilson等认为天疱疮皮损好发于头皮部，可能是由于头皮部的靶抗原分布较多，因此检测患者头皮毛囊天疱疮抗体的沉积情况，可能有助于天疱疮的诊断。李晓东等［8］用直接免疫荧光方法测定了21例天疱疮患者拔出的头发上残留毛囊中和皮损处天疱疮抗体的沉积，认为皮肤、毛发切片和拔发直接染色三者的结果一致，但直接染色拔出毛发的方法简单、快速（1～2h）的优点。免疫印记技术是近20年发展起来的一项免疫学检测技术，它不但特异性强且敏感性高，国外已用于PV抗体的检测中。耿龙等［9］应用免疫印记技术检测天疱疮抗体，认为其敏感性稍高于免疫荧光，为天疱疮的诊断提供重要的依据。

随着检验技术的发展，抗独特型抗体已广泛应运于多种自身免疫性疾病的诊断和实验性治疗。石磊等［10］用酶联免疫吸附试验检测49例天疱疮患者，敏感性和特异性达80%以上，高于免疫荧光，认为相对免疫荧光，酶联免疫吸附试验是一种简便、敏感和特异性高的天疱疮血清学诊断方法，并能辅助鉴别PV和PF。而免疫荧光需一定的仪器设备，在基层医院较难开展，影响实验的因素较多，结果的判定有一定的主观性；实验结果是一系列的抗体滴度，不能区分Dsg1、Dsg3的特异性抗体。

4天疱疮抗体的临床意义

赵永铿等［11］在不同部位天疱疮抗体滴度的研究中发现，皮损边缘部位直接免疫荧光阳性时抗体滴度较其他部位“正常”皮肤滴度高，而皮损边缘的“正常”皮肤是皮损不断向外扩展之处，说明抗原抗体反应达到一定程度才会产生皮损。

抗体对桥粒的影响：聂祝湘等［12］建立了棘层松解模型，发现在加入天疱疮抗体后，24h仅引起细胞间隙增宽，48h引起部分桥粒的破坏，72h可致胞膜变平滑，桥粒消失。

一般认为血清中天疱疮抗体的稀释度与病情的严重程度相平行。病情严重、范围广的滴度较高，而病情较轻、范围较小的滴度较低。天疱疮抗体滴度可作为临床观察和治疗的指标。

在皮质类固醇激素治疗天疱疮中发现，皮质类固醇激素的应用，患者的临床症状明显改善，天疱疮抗体滴度也随着降低，但是，Judd等［13］发现天疱疮抗体滴度降低的速度明显落后于临床症状的改善速度。这表明：在皮质类固醇激素开始治疗和天疱疮抗体的滴度降低之间，有一个延滞期，这个延滞期比皮质类固醇激素开始治疗与临床皮疹开始改善之间的时间长。因此，顾富祥等［14］认为用皮质类固醇激素使用的开始剂量，不应使用抗体的滴度作指标，而应根据患者的皮损的严重程度和治疗的反应决定；但在决定皮质类固醇激素治疗的期限长短时，不应只根据临床症状的改善，而应根据血清循环抗体的滴度，来决定是否减少激素的剂量或停药。

【参考文献】

1HuntDM,SahotaVK,TaylorK,etal.Clusteredcadheringenes:asequence-readycontigforthedesmosomalcadherinlocusonhumanchromosome18.Genomics,1999,62(3):445-455.

2杨春俊，张学军，杨森，等.天疱疮抗体结合靶抗原的定位研究.中华皮肤科杂志，1999，32：381-382.

3翟志芳，刁庆春.天疱疮抗原的研究进展.国外医学·皮肤性病学分册，2004，30：72-74.

4AmagaiM,TsunodaK,ZillikensD,etal.Theclinicalphenotypeofpempnigusisdefinedbytheanti-destnoglcinantoantibodyprofile.JAmAcadDermatol,1999,40(2Ptl):167-170.

5李渝，刁庆春，王鲁，等.天疱疮抗体亚类在天疱疮发病中的作用.中华皮肤科杂志，2000，33：219-221.

6聂祝湘，刘荣卿.天疱疮与细胞黏附分子.国外医学·生理、病理科学与临床分册，1995，15：233-235.

7MemarO,ChristeosenB,RajaramanS,etal.Juductionofblistercausingandbodiesbyacecombinantfull-length,butnottheextracellularklomairofthepemphigusvulgariaantigen(desmoglein3).JImmunnl,1996,157(7):3171-3177.

8李晓东，赵玉铭，陈洪铎，等.天疱疮患者头发毛囊与皮损中自身抗体沉积的比较.中国皮肤性病学杂志，2005，19：196-205.

9耿龙，刘海军，梁再赋，等.应用免疫印记技术检测天疱疮抗体方法的建立.中国微生物和免疫学杂志，2001，21：105-107.

10石磊，张福仁，周桂枝.酶联免疫吸附实验检测血清天疱疮抗体的评价.中华皮肤科杂志，2004，37：83-85.

11赵永铿，罗瑞园，林页新.天疱疮患者不同部位皮肤及不同稀释度荧光抗体直接免疫荧光检查的对照研究.中华皮肤科杂志，1989，23：328-329.

12聂祝湘，刘荣卿，叶庆和.天疱疮抗体桥粒影响的动态观察.中华医学杂志，1996，76：691-693.

抗原范文篇5

【关键词】乙型肝炎病毒；宫内感染；人类白细胞抗原DR等位基因(HLA-DR)

肝炎是一种严重危害人类健康的世界性传染病，我国是乙肝高发区，乙肝病毒的母婴传播不仅造成人群中众多的HBsAg携带者，而且是引起成人慢性肝炎、肝硬化以及肝癌的重要因素。迄今，多数学者认为，人类白细胞抗原DR等位基因(HLA-DR)与乙型肝炎病毒(HBV)感染密切相关，而HLA-DR等位基因与HBV宫内感染的关系争议较多。本文通过研究HLA-DR3、DR7、DR13、DR53与HBV宫内感染的关系，探讨HBV宫内感染的遗传易感性，为防制HBV宫内感染提供理论依据。

1对象与方法

11对象以2003年6月～2004年11月太原市省各市级医院筛检，并在太原市传染病院妇产科进行产前检查及分娩的HBsAg阳性孕妇及其新生儿各187例作为研究对象。并根据新生儿有无宫内感染，分为宫内感染组(29例)和宫内未感染组(158例)，2组在年龄分布、文化程度、职业构成等均衡可比。

12方法

121标本采集及处理收集孕妇肘静脉血及新生儿出生24h内且未注射高效价免疫球蛋白(HBIG，hepatitisBimmuneglobulin)的股静脉血各2ml，4℃冰箱保存，6h内以4000r/min4℃离心15min，分离血清与血块，-20℃保存备检。

122乙肝血清标志物检测采用酶联免疫吸附(ELISA)法，试剂盒（上海科华实业总公司）。

123HBVDNA检测(1)HBVDNA提取：参考文献〔1〕，采用异硫氰酸胍一步法提取血清DNA；(2)HBVDNA的扩增：采用巢式聚合酶链反应(nPCR)。

124HLA-DR等位基因检测(1)人类基因组DNA的提取十二烷基磺酸钠（SDS）蛋自酶K法提取血块基因组DNA。(2)HLA-DR等位基因扩增：参考文献〔2〕的引物设计采用聚合酶链反应／序列特异性引物(PCR-SSP)技术检测孕妇及其新生儿外周静脉血血块中HLA-DR3、DR7、DR13、R53基因型分布及频率。(3)PCR产物的检测：取扩增产物5～10μl，按5：1(V：V)与溴酚兰混匀，加样于15％琼脂糖凝胶(含05μg／ml溴化乙锭)板，在60V／cm电压下泳动50min，紫外灯下观察结果。

125新生儿HBV宫内感染诊断标准新生儿外周血血清HBsAg和/或HBVDNA阳性，即诊断为HBV宫内感染。

13统计分析

资料输入SPSS115软件进行统计分析；计算各指标的阳性率，四格表χ2、Fisher确切概率、OR值及OR95%CI。

2结果

21HBsAg阳性孕妇及其新生儿HLA-DR扩增图谱提取的血块DNA经PCR扩增后呈现明显条带，与标准分子标记物（Marker）条带比较，确定HLA-DR基因型（图1，2，3，4）。中国论文联盟

DR3+：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR3阳性扩增产物，扩增产物片断长度为151bp;DR3-：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR3阴性扩增产物；M：标准分子标记物(Marker)

图1HLA-DR3等位基因的PCR扩增产物电泳结果（略）

DR7+：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR7阳性扩增产物，扩增产物片断长度为232bp；DRT-：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR7阴性扩增产物；M：标准分子标记物(Marker)

图2HLA-DR7等位基因的PCR扩增产物电泳结果（略）

DR13+：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR13阳性扩增产物，扩增产物片断长度为130bp；DR13-：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR13阴性扩增产物；M：标准分子标记物(Marker)

图3HLA-DR13等位基因的PCR扩增产物电泳结果（略）

DR53+：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR53阳性扩增产物，扩增产物片断长度为213bp；DR53-：HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR53阴性扩增产物；C：内对照

注：DR53引物与内对照引物可能发生了引物间的错配等，故分管同时扩增

图4HLA-DR53等位基因的PCR扩增产物电泳结果（略）

22HLA-DR与HBV宫内感染的关系

221孕妇HLA-DR等位基因分布及频率比较（表1）宫内感染组孕妇HLA-DR3基因频率明显高于宫内未感染组，经检验，差异有统计学意义（OR=4709,P=0007）；HLA-DR7、DR13、DR53基因频率在宫内感染组与宫内未感染组孕妇比较，经检验，差异无统计学意义（P>005）。

表1宫内感染组与宫内未感染组孕妇HLA-DR基因分布及频率比较（略）

注：*为fisher确切概率法计算结果

222新生儿HLA-DR等位基因分布及频率比较(表2)宫内感染组新生儿HLA-DR3基因频率明显高于宫内未感染组，经检验，差异有统计学意义(OR=3906，P=0033)；HLA-DR7、DR13、DR53基因频率在宫内感染组与宫内未感染组新生儿比较，经检验，差异无统计学意义(P>005)。

223母婴HLA-DR等位基因同阳性分布及频率比较（表3）母婴HLA-DR3同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较，经检验，差异有统计学意义（OR=596,P=0049），母婴HLA-DR7、DR13、DR53同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较，经验验，差异无统计学意义（P>005）。

表2宫内感染组与宫内未感染组新生儿HLA-DR基因分布及频率比较（略）

注：*为fisher确切概率法计算结果

表3宫内感染组与宫内未感染组母婴HLA-DR同阳性分布及频率比较（略）

注：*为fisher确切概率法计算结果

3讨论

KilpatrickDC〔3〕的研究发现，HLA-A3是人类免疫缺陷病毒(HIV)宫内感染的保护基因，HLA-DR3是HIV宫内感染的易感基因。BosiL等〔4〕采用Logistic回归分析发现，HLA-DR13与发生HCV宫内感染呈负相关，即HLA-DR13是HCV宫内感染的保护因素。在母亲同时感染HIV者中，HLA-DR13和HIV同时感染在HCV宫内感染的发生中具有独立而相反的作用，即HLA-DR13是HCV宫内感染的保护因素；HLA-DR13表达在未发生HCV，宫内感染和发生了HCV宫内感染者的OR值为84(95％CI=11～608)，且母乳喂养不影响该HCV宫内感染的危险度。王素萍等〔5〕以HBsAg阳性孕妇新生儿为研究对象，随机选择发生及未发生HBV宫内感染的新生儿各20例，应用试剂盒提供的序列特异性引物(sequencespecificprimers,SSP)采用PCR-SSP技术扩增HLA-DR基因区18对等位基因，判定HLA-DR抗原的型别，计算HLA-DR抗原各型别出现频率并分析其在2组间的差别，发现DR3、DR51在宫内感染组的频率较高，分别为45％，40％。在非宫内感染组分别为20％，15％，P值分别为018，016。DR53在非宫内感染组的频率较高，为60％，在宫内感染组为35％。推测HLA-DR3、DR51可能是HBV宫内感染的易感型，而DR53有可能是具有保护作用型别。刘海英等〔6〕采用PCR-SSP法合成相应的特异性引物序列，对HLA-DR3、DR4、DR13、DR15进行研究。结果显示，宫内感染组孕妇HLA-DR3的基因频率为50％，显著高于宫内未感染组的147％(RR=58，χ2=490,P<005)，其余各基因表型比较，差异无统计学意义；宫内感染组新生儿HLA-DR3的基因频率为30％，明显高于宫内未感染组的74％，但差异无统计学意义(P>005)，提示孕妇或胎儿携带HLA-DR3，易导致HBV宫内感染，即孕妇或胎儿HLA-DR3阳性是HBV宫内感染的易感基因。本文同样采用PCR-SSP技术研究HLA-DR特异性等位基因与HBV宫内感染的关系。结果表明，HBsAg阳性孕妇及其胎儿同时或任一携带HLA-DR3，易导致HBV宫内感染；HLA-DR3是HBV宫内感染的易感基因。提示在防制HBV宫内感染时不能忽视人类遗传因素的作用，应采取综合措施防制HBV宫内感染。

参考文献

〔1〕向海平，郭雁宾，孟庆华，等.聚合酶链反应定量检测乙型肝炎病毒DNA及其临床意义分析［J］.中华实验和临床病毒学杂志，1999，13（1）：89-90.

〔2〕OlerupO,ZetterquistH.HLA-DRtypingbyPCRamplificationwithsequencespecificprimers(PCR-SSP)in2hours:analternativatoserologicalDRtypinginclinicalpracticeincludingdonor-recipientmatchingincadaverictransplantation［J］.TissueAntigens,1992,39:225-229.

〔3〕KilpatrickDC,HagueRA,YapPL,etal.HLAantigenfrequenciesinchildrenborntoHIV-infectedmothers［J］.DisMarkers,1991,9(1):21-26.

〔4〕BosiI,AncoraG,MantovaniW,etal.HLA-DR13andHCVverticalinfection〔J〕.PediatrRes,2002，51(6)：746-749.

抗原范文篇6

BiologicalactivityoftetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigenandCD3molecule

【Abstract】AIM:Tostudythebiologicalactivityoftetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigen(PSA)andCD3molecule.METHODS:Flowcytometry(FCM)wasusedtodetectthebindingactivityofbispecificsinglechainantibodytoCD3positivecelllineJurkatandprostatecarcinomacelllineLNCaP.Theefficacyoftheantibodiyinmediatingtumorcelllysisinvitrowasdeterminedbyusingthe51Crreleasetest.Forinvivoevaluationoftheantibodysactivity,anudemousemodelwasused.ThemicewereinoculatedwithLNCaPprostatecancercells.RESULTS:ItwasdemonstratedthatthetetramerofbispecificsinglechainantibodycouldbindtotheJurkatandLNCaPcellswithhighspecificity.Thepercentsofthecellsbondbytheantibodywere70.4%and81%,respectively.Invitro,withactivatedCTLsaseffectorcells,aspecificlysisofLNCaPcellsmediatedbytheantibodywasconfirmedby51Crreleaseassay.ThespecificlysisrateofLNCaPcellswaspositivelycorrelatedtotBsAbconcentrationoreffector/targetcellratio.Thehighestspecificlysisrateswere(80.3±5.2)%and(78.6±5.5)%infixedantibodyconcentrationgroupandfixedeffector/targetcellratiogroup,respectively.Invivo,theantibodycouldsuppressthetumorgrowthinnudemicesignificantlyascomparedtothegrouptreatedonlywithCTLsandtheuntreatedcontrolgroup(P<0.0001).CONCLUSION:ThetetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigenandCD3moleculehasagoodbiologicalactivityinbindingantigens,mediatinglysisofLNCaPcellsandinhibitingtumorgrowth.

【Keywords】prostaticneoplasms;antigens,CD3;antibodyaffinity;tetramer

【摘要】目的：研究抗前列腺特异抗原(PSA)/抗CD3双特异性单链抗体四聚体的生物活性.方法：利用流式细胞仪和51Cr释放试验评价双特异性单链抗体四聚体的抗原亲和活性和体外介导杀伤靶细胞的效果.利用裸鼠前列腺癌模型分析其在体内介导细胞毒T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤的能力.结果：抗PSA/抗CD3双特异性单链抗体四聚体可以特异性结合表达前列腺癌细胞和CD3阳性的淋巴瘤细胞，阳性结合率分别为70.4%和81%.在体外，有细胞毒T淋巴细胞存在时该四聚体可引起前列腺癌细胞的裂解，在抗体浓度固定组和效应细胞/靶细胞比例固定组，靶细胞裂解率分别随着效应细胞/靶细胞比例和抗体浓度的增加而增加，最高裂解率分别可以达到(80.3±5.2)%和(78.6±5.5)%.与对照组比较，接种前列腺癌细胞的裸鼠在体内注射激活的细胞毒T淋巴细胞的同时接受该四聚体的治疗后，肿瘤生长明显受到抑制(P<0.0001).结论：抗PSA/抗CD3双特异性单链抗体四聚体具有良好的生物学活性，具有体外杀伤肿瘤细胞和体内抑制肿瘤生长的作用.

【关键词】前列腺肿瘤；抗原，CD3；抗体亲和力；四聚体

0引言

免疫治疗因其可以调动机体自身的免疫力，弥补患者免疫系统缺陷，达到治疗肿瘤的目的而成为肿瘤治疗方法中的重要组成部分.其中可以激活细胞毒T淋巴细胞并使其在肿瘤局部聚集的抗CD3/抗肿瘤特异性抗原双特异性抗体倍受研究者瞩目［1］.人p53基因表达产物以四聚体形式存在，其四价功能域表达产物可自动装配成四聚体.我们在成功构建了人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因［2］和制备抗前列腺特异抗原/抗CD3双特异性单链抗体(BsAb)的基础之上［3-4］，将四价功能域融合基因与双特异性单链抗体基因拼接，制备双特异性单链抗体的四聚体［5］，明显提高了双特异性单链抗体的亲和力,改善了其生物活性.

1材料和方法

1.1材料抗PSA/抗人CD3双特异性单链抗体四聚体(tBsAb)［5］由本实验室制备并保存；前列腺癌细胞系LNCaP和CD3阳性的淋巴瘤细胞系Jurkat购买自美国标准培养收集所(ATCC,USA)；健康纯种雌性Balb/c裸鼠（6~9wk）购买自中科院上海实验动物中心.FITC标记的抗myc单克隆抗体(9E10)为第四军医大学免疫教研室谢鑫博士惠赠；其它常规试剂均为进口或国产分析纯.

1.2方法

1.2.1抗体亲和活性的鉴定前列腺癌细胞LNCaP和CD3阳性的淋巴瘤细胞Jurkat分别用含100g/LFCS的RPMI1640调整细胞浓度为5×109～1×1010/L，两种细胞悬液各取2份，40μL/份，分别加入纯化后的抗体（tBsAb），调整抗体终浓度为20mg/L，再加50μL1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清，4℃放置30min，用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2mL，离心1000r/min，5min，弃上清，加入50μL1∶1500的FITC标记的抗myc单克隆抗体，充分振摇，4℃放置30min，用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2mL，离心1000r/min，5min，弃上清，加入1mL固定液，进行流式细胞仪(FCM)检测.用正常鼠IgG替代抗体，按上述方法处理后作为阴性对照.

1.2.2效应细胞的制备利用密度梯度离心方法从正常人肝素化血液中提取外周血单核细胞（PBMC），加入低温PBS重悬浮后，离心1000r/min，10min，弃上清，加入含有100g/LFCS,2mmoL/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640重悬浮.PBMC悬液移入250mL细胞培养瓶，CO2孵箱孵育1d，将非贴壁细胞移入新的培养瓶，更换培养液，并加入终浓度150U/mL的IL2，孵育3d，再次更换培养液，并将IL2的终浓度调整为100U/mL.之后每3d更换培养液，连续培养8wk后做为效应细胞.

1.2.3细胞毒实验利用51Cr释放试验鉴定双特异性抗体介导的效应细胞杀伤肿瘤细胞的效果.靶细胞的标记：将5×106LNCaP细胞和7400kBq（200μCi）Na2［51Cr］O4在37℃的50mL/LCO2孵箱中孵育1d，RPMI1640洗涤2次后，加入96孔培养板中（1×104/孔）.将靶细胞分为对照组和tBsAb组，对照组中应用小鼠IgG.每组再分为抗体浓度固定组和效应细胞/靶细胞比例固定组.另设仅含标记靶细胞的自然释放对照孔及含有标记靶细胞和10mL/LTritonX100的最大释放对照孔.抗体浓度固定组的抗体浓度为30μg/L，效应细胞/靶细胞比例从0.5∶1至30∶1不等；效应细胞/靶细胞（E/T）比例固定组中E/T为20∶1，抗体浓度为0.1~300μg/L，相同实验条件重复4孔.50mL/LCO2孵箱，37℃放置4h.然后，经过离心提取培养上清（150μL），γ计数器测量每份上清的cpm值.计算特异性释放率：特异性释放率(%)＝（实验孔cpm-自然释放对照孔cpm）/(最大释放对照孔cpm-实验孔cpm)×100%.

1.2.4裸鼠动物模型四只健康裸鼠静脉注射tBsAb和效应细胞，验证抗体及效应细胞毒副作用.将36只裸鼠随机分成3组：非治疗组、对照组和tBsAb组，非治疗组不接受任何治疗，对照组每日仅接受静脉注射效应细胞（1×107），tBsAb组静脉注射1×107效应细胞和200μgtBsAb.分别于裸鼠腹侧皮下注射1×107LNCaP细胞，等肿瘤体积达到约100mm3时，开始各组治疗方案并计时，肿瘤体积每周测量1次，体积计算：宽2×长×0.52.6wk后将裸鼠用CO2处死.

统计学处理：利用SAS8.1统计软件分析,统计图利用SPSS13.0制作，采用重复测量方差分析.P<0.05为具有统计学意义.

2结果

2.1流式细胞仪FMC显示双特异性抗体四聚体可以特异性结合前列腺癌细胞LNCaP和CD3阳性的淋巴瘤细胞Jurkat，与LNCaP细胞和Jurkat细胞的阳性结合率分别为70.4%和81%(图1).

A:Jurkat细胞阴性对照组;B:tBsAb与Jurkat细胞的结合；C:LNCaP细胞阴性对照组;D:tBsAb与LNCaP细胞的结合.

图1FCM分析tBsAb分别与LNCaP和Jurkat的结合活性（略）

2.2体外介导的细胞毒作用tBsAb可以有效的介导效应细胞（T细胞）对靶细胞（LNCaP细胞）的杀伤，靶细胞裂解百分比在实验组（效应细胞/靶细胞比例固定组和抗体浓度固定组）和对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.0001）.在效应细胞/靶细胞比例固定组，随着tBsAb浓度的不断增加，特异性释放率显著增加（P<0.0001）；同样，在抗体浓度固定组，随着效应细胞/靶细胞比例的逐渐增加，特异性释放率显著增加P<0.0001,图2).

A:效应细胞与靶细胞比例固定组;B:抗体浓度固定组.

图2tBsAb介导的特异性杀伤（略）

2.3裸鼠动物模型4只接受静脉注射tBsAb和效应细胞的健康裸鼠无明显异常表现，证实tBsAb和效应细胞无明显毒副作用，裸鼠可以耐受.36只入组裸鼠中，共33只完成6wk治疗，3只死亡，其中1只死于感染，2只死亡原因不明，将死亡裸鼠实验资料剔除，最终每组实验裸鼠数目为非治疗组（n=12），对照组（n=11）和tBsAb组（n=10）.重复测量方差分析结果显示：非治疗组和对照组肿瘤体积逐渐增大，tBsAb组肿瘤生长明显受到抑制，三组之间差异具有统计学意义（P<0.0001，图3).

图3tBsAb的治疗作用（略）

3讨论

免疫治疗因其可以调动机体自身的免疫力，弥补患者免疫系统缺陷，达到治疗肿瘤的目的而成为肿瘤治疗方法中的重要组成部分.近年来，越来越多的研究结果显示：肿瘤免疫治疗是一种具有广阔应用前景的治疗方法.由于抗免疫效应细胞表面标志物，如CD3,CD2,CD16和CD64等抗体可以有效激活效应细胞，因此利用同时能识别免疫效应细胞及肿瘤相关抗原的双特异性抗体可以增加肿瘤部位效应细胞的数量并激活效应细胞，使其发挥细胞毒功能.

本实验室利用分子克隆的方法成功构建了抗PSA/抗人CD3双特异性单链抗体，试图增加并活化前列腺癌组织周围的细胞毒T淋巴细胞，介导T淋巴细胞对前列腺癌细胞的杀伤，达到治疗前列腺癌的目的.但是，其亲和力和肿瘤杀伤活性不理想［4］.之后我们利用p53四价功能域可以将P53分子自动组装成四聚体的特性，构建了人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因［2］，将其融合在BsAb基因的3''''端，构建了抗PSA/抗人CD3双特异性单链抗体的四聚体基因，并获得真核表达，明显提高了原双特异性单链抗体的亲和力［5］.

我们研究表明,tBsAb可以特异性识别靶细胞，与靶细胞的亲和力明显高于原双特异性单链抗体（BsAb）.体外杀伤实验结果显示tBsAb可以介导细胞毒T淋巴细胞对靶细胞的杀伤，介导杀伤效率明显优于BsAb［4］.同时，这一结果在裸鼠前列腺癌模型体内实验中得到进一步证实：tBsAb基本可以达到抑制肿瘤生长的目的.当然从实验结果中还可以看出：只有当效应细胞成倍于靶细胞，并且抗体浓度达到一定水平时，抗体介导细胞毒T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力才能得到发挥，并且这种能力的大小与效应细胞/靶细胞比例和抗体浓度程正相关.

【参考文献】

［1］KontermannRE.Recombinantbispecificantibodiesforcancertherapy［J］.ActaPharmacolSin,2005,26(1):1-9.

［2］王栋，王禾，武国军，等.人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因的构建及空间构象分析［J］.细胞与分子免疫学杂志，2001,17(4)：381-383.

［3］武国军，郝晓柯，白玉杰，等.抗人精浆蛋白单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆及序列分析［J］.第四军医大学学报，1998，19(5)：484-487.

抗原范文篇7

2肿瘤疫苗的设计策略

2.1总体思路针对肿瘤抗原在机体内免疫原性下降，造成特异性细胞免疫激活不足，外周免疫耐受的状况，肿瘤疫苗设计策略的总体思路是应用各种技术，增强免疫系统对肿瘤抗原的识别能力，改善免疫微环境，引发有力的特异性抗肿瘤细胞免疫，阻止肿瘤进展，最终消除肿瘤.

2.2肿瘤细胞疫苗肿瘤细胞疫苗是将整个肿瘤细胞作为抗原导入患者体内，诱导特异性的抗肿瘤免疫应答.由于肿瘤细胞带有肿瘤的全部抗原，无需考虑分离肿瘤特异性抗原（tumorspecificantigen,TSA），而且由于自体肿瘤细胞具有和正常组织相同的人类白细胞抗原，不会引发机体的免疫排斥反应，因此被认为是理想的肿瘤疫苗方案.但是自体肿瘤组织来源十分有限，并且考虑到TSA的表达具有一定的组织特异性，因此这种方法的应用受到了限制［3］.后来，人们开始使用人工培养的同种异体肿瘤细胞系进行肿瘤疫苗的研究.不同肿瘤细胞的混合能够提供一系列的TSA，有利于增加肿瘤疫苗的免疫原性，减小其发生抗原丢失的几率［2］.但是，单独使用自体或异体的肿瘤细胞难以产生足够强度的免疫应答，免疫佐剂的使用极大地改善了这种情况.随着基因工程的进展，人们开始对肿瘤细胞进行基因修饰，将编码免疫共刺激分子如CD80，CD86的基因，导入肿瘤细胞中，为T细胞活化提供第二信号，有效地打破了肿瘤的外周免疫耐受.近年来，也有人将编码一些细胞因子如IL2，IL12，粒巨噬细胞集落刺激因子（granulocytcmacrohagecolonystimulatihyfactor,GMCSF）等的基因导入肿瘤细胞，期望通过细胞因子蛋白的表达，改善肿瘤组织局部免疫微环境，增强T细胞的抗肿瘤免疫效应［4］.然而，近些年来临床实验表明，即使在实验中能够诱发满意免疫反应的肿瘤细胞疫苗，在转化成临床有效的治疗性肿瘤疫苗时都遇到了困难.Fifis等［5］的研究发现，大鼠结肠癌细胞系经体外培养后免疫同源小鼠，引发了免疫反应和肿瘤保护效应.然而，当他们对荷瘤小鼠进行同样处理时，却大大促进了肿瘤的生长，提示肿瘤细胞能够通过一系列机制抑制机体的抗肿瘤免疫反应，包括分泌免疫抑制因子IL10，肿瘤生长因子β阻止有效的免疫反应；分泌血管内皮细胞生长因子，GMCSF等因子活化具有免疫抑制作用的骨髓源性细胞；激活特异的调节性CD4+CD25+T细胞以下调细胞毒性T淋巴细胞的效应等.

2.3肿瘤抗原疫苗肿瘤能够引起机体特异性免疫反应的现象引发了对肿瘤抗原的研究.肿瘤抗原包括多个层次：完整的蛋白质分子、抗原肽及纯化的DNA.关于肿瘤DNA疫苗，下文将另行讨论.目前将肿瘤抗原分为TSA和肿瘤相关抗原（tumorassociated,TAA）.TSA是指只存在于肿瘤细胞，而TAA并非肿瘤细胞特有的抗原，只是在发生肿瘤时此类抗原的表达明显上调.Tabi等［2］认为，肿瘤抗原必须在全部或大多数患有相同肿瘤患者的大部分肿瘤细胞中呈普遍的高表达状态.他将肿瘤抗原分为5类：①突变抗原；②肿瘤细胞过度表达抗原；③癌睾抗原;④组织特异性分化抗原；⑤病毒抗原.

单独应用肿瘤抗原蛋白存在免疫原性差的问题，这是由于肿瘤细胞可通过抗原、HLA缺失等机制发生逃逸.刘宏利等［6］结合了肽疫苗和DNA疫苗各自的特点，以P815肿瘤细胞的CTL表位（P815A3543）为模型，合成该表位加多聚赖氨酸的颗粒性多肽，并制备含有编码此表位和GMCSF基因的表达质粒，制成了新型的颗粒性肽DNA复合疫苗，这种疫苗利于APC的摄取加工，可诱导有效的CTL应答，从而预防小鼠致命性P815肿瘤细胞攻击，并可部分根除肿瘤.

超抗原能够激活全部携带T细胞抗原识别受体Vβ片段的T细胞,激活的T细胞克隆数约是普通抗原的1000倍,产生强大的杀伤靶细胞的作用.马文学等［7］用已构建的重组跨膜型超抗原的表达载体pET28aTMSEA转化E.coliBL21(DE3)pLysS宿主菌,并诱导其表达跨膜型超抗原融合蛋白，实验结果显示，跨膜型超抗原融合蛋白能够锚定在肿瘤细胞膜上，显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并延长其生存期,为肿瘤抗原疫苗的研究提供了新思路.

热休克蛋白（heatshockprotein,HSPs）作为细胞内的分子伴侣，通过其多肽结合结构域与一系列肿瘤相关抗原形成复合物，同时HSPs通过HSP受体CD91和LOX1介导被APC摄取［8-9］，于是，将肿瘤抗原与HSPs在基因或蛋白水平进行连接，可使机体提高特异性和非特异性抗肿瘤免疫的水平.自体肿瘤HSPgp96抗原肽疫苗已进入临床Ⅲ期，但是由于这种疫苗具有很强的个体特异性，因此只对同源肿瘤起作用，而且由于自体肿瘤HSP抗原肽复合物需要从肿瘤患者体内提取，来源受到了很大限制.目前研究方向是体外合成HSP抗原肽疫苗，如将HSP与肽或全蛋白进行连接；将HSP的DNA与抗原DNA连接后表达融合蛋白［10］；或将HSP基因直接注入肿瘤细胞提高其免疫原性［11］.

独特型(idiotype，Id)单抗原显著优点在于它能引发针对相应自身抗原的体液免疫应答，抗Id的抗体(Ab2)能够模拟TAA，并作为TAA的内影像诱发抗肿瘤免疫.Chang等［12］研究了小鼠抗独特型mAbMK223模拟人类高分子量黑色素瘤相关抗原（HMWMAA）的结构基础，发现MK223重链的互补决定区（CDR）3（H3）、轻链的CDR1（L1）在三维结构上紧密相连，该区域的部分氨基酸序列与HMWMAA核心蛋白的相似折叠区具有同源性，同时发现组成MK223H3环的15氨基酸残肽在体内和体外均可与HMWMAA引发相似的免疫反应.抗Id抗体已进入临床研究阶段，在淋巴瘤、结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤的治疗中表现出了较好效果.CD55是表达在结直肠癌细胞表面的糖蛋白，可保护肿瘤细胞免受补体的攻击，Ullenhag等［13］用模拟CD55的人类抗IdmAb105AD7对67例结直肠癌患者进行了免疫，大多数患者在酶联免疫斑点试验和免疫细胞增殖反应中表现出了抗肿瘤免疫反应.

2.4肿瘤DNA疫苗肿瘤DNA疫苗的原理就是将编码肿瘤特异性抗原的裸DNA分子直接注入机体或者经载体携带后注入机体，肿瘤DNA被体内肿瘤细胞或正常细胞识别并摄入，在细胞内表达肿瘤特异性抗原，引发机体持久的细胞和体液免疫.肿瘤DNA疫苗由质粒DNA骨架、抗原DNA和真核细胞基因调控序列组成.

肿瘤特异性DNA分子在体内被肌肉、皮肤、黏膜等易感处的细胞摄取后，表达出抗原蛋白，经加工处理后与MHCⅠ分子结合呈递于细胞表面，激活CD8+T细胞，刺激CTL的形成和分化，产生细胞免疫作用；还有一部分抗原蛋白分泌至细胞外，被抗原提呈细胞吞噬加工后与MHCⅡ分子共同表达于细胞表面，呈递给CD4+T细胞，激活体液免疫应答［14-15］.DNA疫苗不仅激活了肿瘤特异性体液免疫应答，产生了大量抗体，还激活了被认为是人体抗肿瘤免疫关键细胞的CD8+T细胞［16］，这无疑是肿瘤DNA疫苗的一大优势.而且由于DNA疫苗分子进入人体后才开始其抗原蛋白的合成表达，因此DNA疫苗能够模拟病毒感染的自然过程，合成蛋白被降解加工，作为内源性分子由MHCⅠ分子提呈给CD8+T细胞，激活强有力的细胞免疫应答，较之肿瘤抗原肽进入人体经APC加工提呈给CD4+T细胞，再激活体液免疫要有效得多.同时，携带肿瘤抗原基因的质粒DNA可长期在宿主细胞内控制表达肿瘤抗原蛋白，因此具有长期持续的效果，有望使机体获得持久的抗肿瘤免疫功能.

Niethammer等［17］用携带编码癌胚抗原（carcinoembryonicantigen,CEA）基因的沙门氏菌感染小鼠，联合抗体IL2融合蛋白，观察到MHCⅠ的表达，大量CD8+T细胞被激活，100%的小鼠皮下肿瘤完全消除，75%的小鼠肺转移得到抑制.CD2，CD25，CD28以及CD48，CD80水平的明显上调表明CTL和负责抗原提呈的DCs在接受DNA疫苗的免疫刺激后得到了有效的激活.然而在临床研究中，DNA肿瘤疫苗没有达到令人满意的效果.Conry等［18］用表达CEA和HBV表面抗原的质粒DNA免疫17例结肠癌转移患者，未见明显的临床变化，患者产生针对CEA的淋巴细胞增殖但未检测到CEA特异性抗体.然后,人们对DNA疫苗做了一系列改进，主要从递送系统和免疫佐剂两方面加强质粒DNA的免疫原性.基因枪运载质粒DNA的效率远远高于普通注射器和生物注射器，在Trimble等［19］对此进行的比较中，基因枪运载质粒DNA的方法诱导出了最多的CD8+T细胞和最佳的抗肿瘤免疫反应.由于这种途径能直接转染组织局部的Langerhans细胞［20］，因此诱导免疫所需要的质粒DNA用量可大大减少，同时，免疫佐剂也被用于质粒DNA.研究证明，将编码细胞因子、细菌毒素、蛋白佐剂的DNA与携带抗原基因的质粒DNA有机融合后，能加强质粒DNA的免疫原性［21］.然而，Lima等［22］的研究发现,用CEA和GMCSF融合DNA疫苗免疫小鼠后，高剂量组CEA引发的特异性体液和细胞免疫得到大大激活，但同时也产生了大量抗GMCSF的自身抗体，而用单独的CEADNA疫苗免疫小鼠，肿瘤生长被完全抑制.这提示肿瘤抗原基因和细胞因子基因的融合疫苗在增强疫苗免疫效能的同时打破了机体对于细胞因子的免疫耐受,从而降低细胞因子的免疫佐剂功能,甚至可能对致敏宿主造成长期的损害［22］.

除了质粒DNA外,病毒载体的DNA疫苗也进入了临床研究阶段.病毒载体的DNA疫苗有更强的激活固有免疫反应的能力，通过TLR依赖和非依赖途径募集和活化抗原特异性T细胞，同时病毒载体激活的炎症信号能够影响IFN1依赖的CD8+T细胞的局部扩增和免疫记忆的形成.最常用的病毒载体是重组腺病毒和重组痘病毒载体［23］，重组腺相关病毒、α病毒、口腔泡状病毒、单纯疱疹病毒还处于早期研究阶段.ATP依赖的抗原呈递相关转运蛋白（TAP1）在抗原直接提呈给CD8+T细胞和外源性抗原在树突状细胞（DCs）中交叉提呈的过程中发挥着重要作用.由于TAP1在肿瘤细胞中表达极度低下，肿瘤细胞表面抗原的表达缺失造成其极易发生免疫逃逸.Lou等［24］给恶性黑色素瘤小鼠注射编码人TAP1的重组不复制腺病毒，诱导出了有效的抗肿瘤CTL反应，肿瘤浸润性的DCs细胞增加，记忆性T细胞亚类增多，动物存活期延长.而在此病的研究中，携带表达MAGE1和MAGE3迷你基因的重组ALVAC在30例黑色素瘤患者中仅有1例出现免疫反应，2例病情稳定［25］.这可能与患者血清中存在的抗病毒载体的抗体有关.

2.5树突状细胞（dendriticcell,DCs）肿瘤疫苗DCs是体内最强大的专职抗原提呈细胞，它能够识别、捕获、加工、提呈抗原引发初始免疫反应.将TAA直接导入DCs，使其发挥提呈抗原并激活T细胞的功能，成为肿瘤免疫治疗的有效途径.方法有用肿瘤细胞裂解产物、肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原多肽、合成肿瘤抗原肽冲击DCs细胞，或用肿瘤来源的RNA冲击DCs，也可以将肿瘤细胞与DCs细胞进行融合，或用肿瘤抗原病毒载体转染DCs.

近年来，热休克蛋白抗原肽复合物激活DCs诱导抗肿瘤免疫受到了广泛关注.HSP70－抗原肽复合物负载的DCs比单独用抗原肽或HSP负载的DCs能更有效地激活T细胞、抑制肿瘤生长，而且HSP辅助提呈肿瘤抗原时使用更小量的抗原肽［26］.Moran等［27］将委内瑞拉马脑炎病毒复制子转染DCs细胞，用其免疫过表达neu原癌基因蛋白的荷瘤小鼠，结果转基因高水平表达，DCs细胞成熟并分泌前炎症因子，诱导活化NEU特异性CD8+T细胞，产生抗NEU的IgG抗体.有趣的是，耗竭小鼠CD4+T细胞而非CD8+T后，T细胞完全失去了抑制肿瘤生长的能力，提示CD4+T细胞在肿瘤生长抑制中发挥了重要作用.肿瘤组织来源的RNA转染DCs被证明具有强大的抗原性、更多的作用靶点和更高的安全性，经过一系列动物实验，目前已进入临床研究.Su等［28］将PSAmRNA转染DCs，免疫治疗转移性前列腺癌，检测了患者外周血PSA水平和癌细胞数量，证明疫苗可引起有效的抗原特异性免疫反应，未见明显毒副作用.

3问题与展望随着对肿瘤免疫机制研究的深入，肿瘤疫苗成为临床预防和治疗肿瘤有效方法的趋势日益明显.尽管肿瘤疫苗的有效性在动物实验中取得了振奋人心的效果，但其在临床研究中的治疗结果尚未令人满意.如何寻找和筛选有效的肿瘤抗原，激活机体的细胞和体液免疫应答；如何打破机体对肿瘤的外周耐受从而更有效的行使其免疫监视功能；如何改善免疫微环境，减少肿瘤对机体免疫反应的抑制；以及后续肿瘤疫苗进入机体的有效途径，免疫方法等均需要进一步的研究.使用佐剂、细胞因子及其它有效的方法，如利用DCs强大的抗原提呈能力，大大增加了肿瘤疫苗的免疫原性；抗肿瘤T细胞的活化需要双信号，共刺激分子B7通过激活T细胞表面的CD28分子活化免疫反应，通过激活细胞溶解性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）分子则抑制免疫反应，有人已设想通过阻断T细胞表面的CTLA4以利于肿瘤杀伤性T细胞克隆的激活；近年来CD4+CD25+自身调节T细胞（Treg）在肿瘤免疫中的抑制作用受到了关注，如何拮抗Treg细胞对抗肿瘤免疫的抑制，优化局部免疫微环境，从而活化免疫细胞识别、排斥肿瘤的作用也是研究的方向.有研究证明，不同的疫苗接种途径及程序会对肿瘤疫苗的治疗效果产生有意义的影响，据此寻找最佳的免疫程序，发挥肿瘤疫苗的优势也值得研究.此外，实验和临床研究发现，肿瘤疫苗对早期肿瘤、手术切除肿瘤或经放化疗已明显缩小的肿瘤具有更好的治疗效果，提示将肿瘤疫苗与手术、化疗、放疗及移植等手段结合起来应用，以达到满意的治疗效果.

随着基础研究和临床试验进一步的开展，我们对肿瘤疫苗的认识也将更加深入，有理由相信，新的安全、有效、抗原性更强、适应范围更广的肿瘤疫苗终将为广大肿瘤患者带来福音.

【参考文献】

［1］林文棠，朱平.临床免疫学［M］.西安:第四军医大学出版社，2002：100-102.

［2］TabiZ,ManS.Challengesforcancervaccinedevelopment［J］.AdvDrugDelivRev,2006,58(8):902-915.

［3］HockertzS.Presentandfutureofcancervaccines［J］.Toxicology,2005,214(1-2):151-161.

［4］MoretTI,SanmartinI,MarcoFM,etal.Nonviraltherapeuticcellvaccinemediatespotentantitumoreffects［J］.Vaccine,2006,24(18):3937-3945.

［5］FifisT,LamI,DorisL,etal.Vaccinationwithinvitrogrownwholetumorcellsinducesstrongimmuneresponsesandretardstumorgrowthinamurinemodelofcolorectallivermetastases［J］.Vaccine,2008,26(2):241-249.

［6］刘宏利，赵建平，倪兵，等.颗粒性肽DNA复合疫苗抗肿瘤免疫的研究［J］.现代免疫学，2004，24：391-394.

［7］马文学，余海，王青青，等.跨膜型超抗原SEA融合蛋白的表达及其对小鼠黑色素瘤的免疫治疗作用［J］.中华微生物学和免疫学杂志,2003,23（7）：567-571.

［8］王少彬,陈理明，陈俊辉.热休克蛋白与肿瘤研究进展［J］.现代肿瘤医学，2005，13（1）：131-133.

［9］NishikamaM,TakemotoS,TakakuraY.Developmentofheatshockproteinswithcontrolleddistributionpropertiesandtheirapplicationtovaccinedelivery［J］.YakugakuZasshi,2007,127(2):293-300.

［10］ChuNR,WuHB,WuTC,etal.Immunotherapyofahumanpapillomavirustype16E7expressingtumorbyadministrationoffusionproteincomprisedofMycobacteriumbovisBCGHsp65andHPV16E7［J］.CellStressChamperones,2000,5(5):401-405.

［11］RafieeM,KanwarJR,BergRW,etal.Inductionofsystemicantitumorimmunitybygenetransferofmammalianheatshockprotein70.1intotumorsinsitu［J］.CancerGeneTher,2001,8(12):974-981.

［12］ChangCC,HernandezGuzmanFG,LuoW,etal.Structuralbasisofantigenmimicryinaclinicalrelevantmelanomaantigensystem［J］.JBiolChem,2005,280(50):41546-41552.

［13］UllenhagGJ,SpendloveI,WatsonNF,etal.Aneoadjuvant/adjuvantrandomizedtrialofcolorectalcancerpatientsvaccinatedwithanantiidiotypicantibody,105AD7,mimickingCD55［J］.ClinCancerRes,2006,12(24):7389-7396.

抗原范文篇8

［关键词］HBV;抗原表位;抗原性;FHVRNA2载体系统

StudyonAntigenicityofHBVRecombinantEpitope

Abstract：ObjectiveConstructionandExpressionHBVrecombinantepitopeinaforeignepitopepresentingvector，andevalutionofdignosticsensitivityforantiHBswithHBVepitope.MethodsOligonucleotidsencodedtwentyfouraminoacids(aaS124147)whichiswithin"a"antigenicdeterninantweresynthesizedandinsertedintoaforeignepitopepresentingcarrierI3site(FHVRNA2cDNAI3).HBVepitopewasexpressedinaprokaryoticcellularsystem(BL21cell).TheexpressionproductwasanalyzedanditsantigenicitywasfurtherstudiedbyELISAandWsternblotmethodwithchimericproteinascoatingantigen.weusedchimericproteinascoatingantigentotestantiHBswithELISAandWsternblotin58seralsamples.ResultsThechimericproteinreactedwithantiHBsseralspecially.ThedetectionpositiveratioofantiHBsis77.5%and68%respectivelybyELISAandWsternblotwithchimericproteinascoatingantigen,thecontrol''''swas62%.ConclusionHBVepitopeexpressedinaforeignepitopepresentingcarrierpossessedgoodantigenicityanddiagnosticvalue.

Keywords：HBV；Epitope；Antigenicity；FHVRNA2carriersystem

乙型肝炎病毒(HBV)是乙型肝炎的病原体，并引起慢性肝炎和肝硬化，而且与肝癌的发生密切相关。迄今，对HBV感染最有力的预防和控制措施，仍是发展疫苗。FHVRNA2载体系统［1］是一个以昆虫小RNA病毒flockhousevirus外壳蛋白为载体的新型抗原表位表达载体，此系统中表达的载体蛋白可自动组装成病毒样颗粒，使插入的外源抗原表位可以暴露在颗粒的表面，保持天然构象和免疫学特性。本研究拟将HBVa抗原表位插入到FHV外壳蛋白上，并对其抗原性及诊断意义进行了研究。

1材料与方法

1.1细胞重组质粒DNA大肠杆菌DH5α用于重组质粒pETEDNA的克隆和扩增。大肠杆菌BL21(DE3)用于重组质粒pETEDNA的表达。质粒DNA在含200μg/ml氨苄青霉素的LB或TB培育中生长，FHVRNA2载体系统即重组pETFHV构建见［1］。

1.2HBV抗原表位及重组pETE的构建和表达

1.2.1HBV抗原表位及重组pETE的构建人工合成HBV特异抗原表位E(氨基酸序列：124CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC147)寡核苷酸序列：正向5’GATGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGC3’；反向3’CTACGTGCTGAGGACGAGTTCCGTTGAGATACAAAGGGAGTACAACGACATGTTTTGGATGCCTACCTTTAACG5’，两端为Bsu36I识别位点，与经Bsu36I作用后的重组pETFHVDNA混匀后置室温连接2h,转化DH5α细胞，接种LB平板(200μg/mlAmp)培养。重组质粒pETEDNA经酶切筛选并经DNA序列测定。

1.2.2携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达重组pET系统中，嵌和蛋白的表达受T7启动子的控制［2］。BL21经重组pETEDNA转化后，在TB培养液中37℃生长16h～18h,细胞经4000r/10min离心沉淀,用超声裂解缓冲液悬浮，超声裂解，裂解液经离心，弃上清，沉淀(包涵体)用8mol/L尿素溶解。

1.2.3SDSPAGE及Westernblot分析方法见前文［1，3］，3，3二氨基苯胺四氢盐酸(DAB)底物试剂为AMRESCO公司产品;第二抗体辣根过氧化物酶(HRP)结合物购自华美公司。

1.3HBV重组抗原表位诊断意义评价

1.3.1ELISA检测血清样本固相ELISA检测如前文所述［1］，以纯化的嵌和蛋白为包被抗原，每孔100μl(含1μg纯化嵌和蛋白)，检测58份乙肝患者血清中抗HBs，与抗HBsELISA检测试剂检测结果比较。阳性判断标准为(检测血清A492底物对照A值)/(阴性血清A492底物对照A值)>2.1。邻苯二胺二氢盐酸(OPD)购自AMRESCO公司；第二抗体辣根过氧化物酶(HRP)结合物购自华美公司；乙肝患者血清由昆明市传染病医院收集;抗HBsELISA检测试剂盒购自上海科华公司。

1.3.2HBV重组抗原表位Westernblot检测血清样本方法见前文［3］，检测了58份乙肝患者血清样本。

2结果

2.1携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达FHVRNA2cDNA载体系统即重组pETFHV构建见文献［4］，其编码产物是FHV外壳蛋白，三维立体结构已得到精确测定，其上有6个可供外源抗原表位插入的位点［5］(见图1)。应用该系统，我们将人工合成HBV抗原表位寡核苷酸序列插入到重组pETFHVDNA上，构建携带HBV抗原表位的重组质粒pETE，经NsiⅠ和NcoⅠ双酶切筛选(见图2)和DNA序列测定无误后转化BL21细胞，高水平表达嵌和蛋白。经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色(见图3)和Westernblot(见图4)分析结果表明，这些嵌和蛋白为携带有HBV抗原表位的重组FHV外壳蛋白。

图1FHV外壳蛋白的三维结构：示可供选择的外源抗原表位序列插入位点L1、L2、L3、I1、I2，I3HBV抗原表位氨基酸序列在FHV中插入位点。（略）

图2重组质粒NcoⅠ+NsiⅠ酶切图（略）

2.2携带HBV重组抗原表位的嵌和蛋白在BL21中的表达与鉴定携带HBV抗原表位的重组质粒pETFHVE在BL21(DE3)转化细胞中高水平表达了携带HBV抗原表位的嵌合蛋白FHVE,其分子质量与阳性对照相同，约为45000(等于载体FHV外壳蛋白的分子质量43000加上HBV抗原表位的分子质量)。经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色(见图3)及Westernblot(见图4)分析结果表明，重组抗原表位显示了抗原性。

图3携带HBVa特异抗原表位的嵌合蛋白SDSPAGE(10%)分析（略）

图4嵌合蛋白的Westernblot分析（略）

2.3HBV重组抗原表位ELISA检测敏感性分析我们用嵌和蛋白为包被抗原用间接ELISA法检测58份乙肝患者血清中抗HBs抗体，检测阳性率为77.5%，高于ELISA试剂盒检测的62%。

2.4HBV重组抗原表位Westernblot以嵌和蛋白为包被抗原用Westernblot检测58份乙肝患者血清中抗HBs抗体，检出阳性率为68%。

3讨论

3.1HBVa抗原表位在疫苗及诊断应用研究中的意义根据HBsAgS蛋白的抗原性不同，将HBV分为9个血清型(即HBsAg亚型)［6，7］：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq-、adrq+。HBVS蛋白第120～第160氨基酸序列是HBV的交叉中和抗原表位即a表位［8］，可诱导产生交叉中和抗体，保护成人免受各HBV亚型的感染。本研究进一步表明，HBVa重组抗原表位可与临床不同来源的血清抗HBs发生特异性结合，具有疫苗研究和诊断意义。

3.2新型抗原表位表达载体系统对于抗原表位来说，决定其免疫原性和抗原性的因素除了氨基酸序列，更重要的是分子的空间构象和呈递给免疫细胞识别的方式。利用FHVRNA2表达载体在大肠杆菌中表达的抗原表位具有良好的免疫原性，免疫小鼠产生了交叉中和抗体［9］，并已成功的在该系统中表达了HIV1V3、轮状病毒Vp4抗原表位和HCV抗原表位，并诱导中和抗体和交叉中和体产生［1，10，11］。HBV抗原表位在FHVRNA2载体系统可中高效地表达，并近似天然构象，能被天然抗HBs抗体特异性识别结合，具有良好的抗原性，在以其为包被抗原用ELISA和Weternblot检测抗HBs中检测敏感性与ELISA诊断试剂盒差异无显著性，在HBV诊断试剂和重组抗原表位亚单位疫苗研究中具有重要意义。

参考文献：

［1］ScodellerEA，TisminetzkySG，PorroF，etal.AnewepitopepresentingsystemdisplayaHIV1V3loopsequencesandinducesneutralizingantibodies［J］.Vaccine,1995，13:12331239.

［2］RosenbergAH,LadeBN,ChuD，etal.VectorsforselectiveexpressionofclonedDNAsbyT7polymerase［J］.Gene,1987，56:125135.

［3］TowbinH，StaehelinT，GordenJ，etal.Electrophoretictransferofproteinfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets：procedureandsomeapplication.Proc.Natl.Acad.Sci［J］.USA，1979，76：43504353.

［4］TisminetzekySG，ScodellerEA，EvangelistiP，etal.ImmunoreactivityofchimericproteincarryingtheHIV1epitopeIGPGRAF，correlationbetweenpredictedconformationandantigenicity［J］.FEBSLetters，1994，353：14.

［5］FisherAJandJohnsonJE.OrderedduplexRNAcontrolsthecapsidarchitectureofanicosahedralanimalvirus［J］.Nature,1993,361:176179.

［6］MagniusLO，etal.AnewvirusspecifieddeterminantofhepatitisBsurfaceantigen［J］.ActaPatholMicrobiolScan,1975，83B:295297.

［7］WandsJR，etal.HepatitisBviralantigenicstructure:signatureanalysisbymonoclonalradioimmunoassays［J］.ProcNatlAcadSciUSA,1984，81:22372241.

［8］MoynihanJS，DmelloFI，etal.48mersyntheticpptideanalogueofthehepatitisBvirus"a"determinantinducesanantiHBsantibodiesresponseafterasingleinjection［J］.JMedVirol,2000，62:159166.

［9］TisminetzekySG.FEBSLetters,1994，353:14.

抗原范文篇9

1近视和其相关抗原

1.1ABO抗原近年来，ABO抗原已被用于免疫遗传性疾病的探究上，已知的可能和ABO抗原有关的眼病有原发性闭角型青光眼、近视性屈光不正、老年性白内障及视网膜色素变性［3］。

有关近视的遗传方式看法不一，主要观点有多因子遗传、隐性遗传、常染色体隐性遗传、单因子遗传、常染色体显性遗传等。胡诞宁等［1］对近视眼患者家族的社会调查结果显示，父母双方均为高度近视者，子代100%为高度近视。而有的资料却表明，双亲单纯性近视或变性近视，子代不一定都出现近视。孙成甲［4］在临床探究中发现，父母都有近视而其子女患近视的不足半数。还有人认为中低度近视的发病有肯定的家族倾向性，和遗传密切相关［5］。另外，通常人眼各部分遗传性不同，轴长、角膜曲率及晶状体后曲率遗传性大，而晶状体厚度及前曲率和遗传无关，Sorsby［4］认为决定近视眼遗传的主要成分是轴长。

1.2HLA抗原HLA是比ABO血型系统更为复杂和重要的强抗原系统。HLA抗原称人类组织相容性抗原，又称人类白细胞抗原，是具有极高度遗传性的多型性膜抗原［6］。HLA抗原根据其构造、机能，分为Ⅰ类和Ⅱ类抗原。

目前已知有20多种眼病和HLA抗原有关［7］。1983年王蓉芳等人［8］发现HLA-B8阳性者易患高度近视，而HLA-B15阳性者不易患高度近视。Пучковская［9］发现，先天性近视和HLA-B7和HLA-B12是有联系的，当近视患者同时有HLA-B7和HLA-B8抗原时，发生视网膜脱离的危险性升高。

至于HLA和疾病相关的机理目前学说较多，有拟态学说、受体学说、免疫应答基因、抑制基因学说、连锁不平衡学说等［10］。目前较为关注的假说是疾病易感基因学说。有人发现，自身免疫病的易感基因不仅和HLA关联，而且和一个特定的HLA单位体关联［11］。

1.3S抗原S抗原即视网膜可溶性抗原。S抗原具有强烈的抗原性和致色素膜炎活性［12］，它能诱发产生实验性葡萄膜炎和实验性视网膜色素变性已被许多学者所证实，而有关近视和S抗原的关系，目前报道很少。Стукалов［13］在对有并发症的高度近视患者进行免疫探究时发现，视网膜抗原的白细胞移动抑制试验的移动指数降低到0.52±0.1。根据免疫学理论，假如移动指数等于1或接近1，说明机体对此抗原无特异性免疫功能；假如移动指数明显＜1，表示机体对此抗原有特异性免疫功能。这就初步证实了有并发症的高度近视患者的机体对视网膜抗原有过敏功能。近年来的探究发现［13］，眼底严重的变性改变不仅见于有并发症的高度近视患者，而且也见于中度甚至轻度近视，眼底的中心及周边都有变性改变，这些都不排除在屈光指数稳定的前提下，近视患者眼底并发症的出现和自身免疫性损伤有关。

1.4胶原(collagen)胶原是组织中主要结构蛋白。现已证实，胶原和组织的增生、分化、粘附和运动以及关节润滑、电解质平衡等都有密切关系［14］。

胶原是一个非常非凡的纤维蛋白群体，它们在结构、功能和组织分布上相互间有差异。在眼组织中，只有Ⅰ～IX型胶原被定位。在所有含有胶原纤维的结缔组织中都含有Ⅰ型胶原［15］，Ⅰ型胶原的功能是给组织以抗张强度。

人眼的巩膜组织由纤维结缔组织构成，而每个纤维束又由胶原纤维组成。在生化探究中发现，Ⅰ型胶原位于眼球的赤道部和后极部之间［16］。Marshall等［17］对老年人巩膜的超微结构进行免疫金染色，结果表明，Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型胶原在巩膜中是存在的，并且在单个的胶原纤维内联结得很紧密。

巩膜胶原纤维的直径范围很宽，大的和小的纤维可能有不同的功能，这些功能决定了巩膜的生化特性［15］。大纤维在胶原分子间交叉连接的密度大，所能承受的张力大，而小纤维和四周基质之间的接触面积大，纤维间相互功能强［18］。

然而，当患近视时，巩膜胶原结构发生了显著的变化，非凡是眼球后极部发生了明显改变，引起近视程度的加深［19］。Curtin等［20］用电镜观察了高度近视患者的巩膜结构，发现高度近视患者巩膜纤维多为板层结构且变薄，交织状态变少，纤维直径明显变细，纤维横断面中异常的锯齿样、星状纤维明显增多。以上情况造成了胶原纤维更大的可伸展性，并减弱了胶原纤维之间的稳定性，使得巩膜后极部纤维的周期性波动范围扩展到62～70nm［19］。Лазук等［19］认为巩膜胶原抗原结构破坏及改变的原因可能是自身免疫反应，为此探究了各种类型进展性近视患者的血清和泪液中的胶原抗体。结果50%～70%的患者在血清中发现了胶原抗体，对照组未发现。在评价免疫应答程度时发现，良性近视患者血清中胶原抗体浓度较高，非凡是学龄期后天性且无并发症的近视患者指标最高，而在并发有混合型周边玻璃体脉络膜视网膜变性的快速(年改变率＞1.0D)进展性近视患者，包括视网膜漆裂、格子样变性和视网膜裂孔，在血清中“缺乏”胶原抗体。因此确定，患中、高度近视的儿童和青少年，形成了对胶原系统的免疫应答。可以初步推测，对于中、高度进展性近视患者来说，对胶原产生的自身免疫反应和血液中循环免疫复合物的堆积，造成了巩膜的损伤，切断了巩膜内分子间和分子内的联系，引起胶原免疫遗传基因的改变，使得近视得以进行性发展，而当对胶原的自身免疫反应“起动”时，血清中胶原抗体的存在是确定的保护因素，因此可以说，血液中胶原抗体的含量相对少时，非凡是在眼底有不同程度的改变时，这种相对低浓度的抗体可以成为巩膜免疫病理学改变的标志，这种改变也是对恶性近视的预告。

2近视患者的体液免疫状况

Пучковская等［9］对56名年轻的近视患者进行了免疫学探究，结果发现IgG含量升高，IgM含量下降。而Казанец等［2］的探究结果是近视患者眼局部和全身IgM水平升高，以局部IgM的升高更为显著，而IgG变化很小。Стукалов等［13］发现，有并发症的高度近视患者血清中IgG降低，IgM升高，免疫复合物增加到98%±5%.对于不同类型近视患者的体液免疫状况还有待进一步的探究。

3近视患者的细胞免疫状况

Пучковская等［9］的探究结果显示，进展性近视患者外周血中淋巴细胞含量较正常人低，T淋巴细胞的相对数和绝对数明显降低。Стукалов等［13］对有并发症的高度近视患者的免疫学探究结果显示，T淋巴细胞、辅助性T细胞和抑制性T细胞以及B淋巴细胞的含量明显降低。可以推测，细胞免疫功能缺陷和近视发病可能有关。Пучковская等［9］的实验性探究也证实了这一点。他以65只新生家鼠为实验对象，用X射线照射家鼠的胸腺部位，结果损害了巩膜组织的正常发育，导致巩膜组织中发生变性改变以及胶原纤维的断裂，影响了巩膜的生物力学特性，成为了轴性近视发展的基础，而细胞免疫即是在胸腺的控制下形成的。

4结论

综上所述，机体免疫状况的改变在近视的发病机理中起着一定的功能。近视患者，尤其是有并发症的高度近视患者的细胞免疫和体液免疫状况和自身免疫性疾病患者的免疫反应指标相似。对于不同类型近视患者的细胞、体液免疫状况，ABO抗原、S抗原，以及不同类型的HLA抗原、不同亚型的胶原抗原和近视发病的关系，还有待进一步的实验和临床探究，这无论对近视病因的理解，还是在临床中用免疫方法预防、猜测和治疗近视都将是有益的。

参考文献

1杨钧.现代眼科手册.北京摘要：人民卫生出版社1993∶563.

2Казанецли，ДюгвскаяЛА．Состояниеместногоисистемного

гуморалъногоиммунитетаулиц

сблизорукостъю．ВестнОфталъмол1988；(5)∶35-36.

3杨朝忠.眼科免疫学.天津摘要：天津科学技术出版社1989∶6.

4孙成甲.近视眼和ABO抗原关系的初步探究.眼科新进展1990；10(1)∶9-11.

5GoldschmidtE,FaurschouS,WorkK.Theimportanceofheredityandenvironmentintheetiologyoflowmyopia.ActaOphthalmol1981;59(5)∶759-762.

6水木信久，大野重昭.HLA抗原遗传子の构成と眼疾患との关连.日眼会志1992；96(4)∶417-431.

7杨朝忠，李昭珍，林振德.老年性白内障和ABO抗原关系的初步探究.眼科新进展1987；7(4)∶7-9.

8王蓉芳，赵桐茂，步坤矩，等.高度近视患者HLA类型的分布.中华眼科杂志1983；19(4)∶228-230.

9ПучковскаяНА，ШулвгинаНС，ВушуеваНН，идр.Нарушениеиммунологческогососояния

организмауболвнЪыхблизорукостЪю．

ОфталЪмолЖурн1988；(3)∶146-149.

10付体辉(译).HLA和疾病相关机理探究的新进展.国外医学分子生物学分册1990；12(1)∶33-34.

11董桂玲，杨朝忠，张荣端.葡萄膜炎的免疫学探究.眼科新进展1991；11(4)∶52-54.

12杨培增，李绍珍，潘苏华，等.视网膜S抗原的提纯及其致色素膜炎活性.中华眼科杂志1990；26(5)∶293-297.

13СтукаловСЕ，ШелетневаМА，КуролапСА.

Клиникоиммунологическиеи

зпидемиологическиеисслованияпривысокои

осложненноимиопии.ВестнОфталвмол1995；(2)∶16-18.

14鲁建华，郑效蕙.胶原和角膜伤口愈合.眼外伤职业眼病杂志1991；(3)∶216-217.

15MarshallGE,KonstasAGP,LeeWR.Collagensinoculartissues.BrJophthalmol1993;77(8)∶515-524.

16KeeleyFW,MorinJD,VeselyS.Characterizationofcollagenfromnormalhumansclera.ExpEyeRes1984;39∶533-542.

17MarshallGE,KonstasAGP,LeeWR.Collagensintheagedhumanmacularsclera.CurrEyeRes1993;12∶143-153.

18ParryDAD,CraigSA.Growthanddevelopmentofcollagenfibrilsinconnectivetissue.In摘要:RuggerA,MottaPM,eds.Ultrastructureoftheconnectivetissuematrix.Boston摘要:MartinusNijhoff1984∶34-64.

19ПазукАВ，СлеповаОС．Исследованиеиммунноиреакдиина

抗原范文篇10

【论文摘要】目的探讨患者手术前传染性指标检测的临床意义。方法对我院1998年10月至2007年11月经初步资料回顾与统计，对受血患者手术前作HBsAg、抗-HCV抗体、抗HIV抗体、梅毒螺旋体抗体4项传染性指标的检测共4692人次。结果其中男2964人次，女1728人次，年龄最大82岁，最小2岁，平均41岁，术前发现HBsAg阳性92人次，抗-HCV抗体阳性3人次，抗HIV抗体阳性4人次，梅毒螺旋体抗体阳性0人次。结论手术前传染性指标检测有效地防范和杜绝了输血纠纷的发生，为医疗安全、医护健康、患者早日康复做出重大的贡献。

抗-HIV抗体检测是采用双抗原夹心两步法检测人血清或血浆样本中的(HIV1/2)型抗体。抗-HCV抗体的检测所用包被抗原为合成多肽抗原和基因工程抗原(包括HCV病毒结构区核心抗原和非结构区抗原)。HBsAg采用夹击心法原理检测人血清原理检测人血清或血浆中的乙肝表面抗原。梅毒螺旋体抗体的检测一步双抗原夹心法原理(ELISA)检测人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体。

根据卫生部《临床输血技术规范》相关规定的要求，结合当前医疗管理标准，我院自1998年10月至2007年11月对临床手术科室明确提出，凡行手术患者，在手术前应作乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，人类免疫缺陷病毒抗体(抗-HIV抗体)，梅毒螺旋体抗体，丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV抗体)4项传染性指标的检测，而有关供血者更是在输血前必须做以上4项指标检测，目的是保证患者用血安全和医务工作者的身体健康。

1、资料与方法

我院1998年10月至2007年11月经初步资料回顾与统计，对受血患者手术前做HBsAg、抗-HCV抗体、抗HIV抗体、梅毒螺旋体抗体4项传染性指标的检测共4692人次，其中男2964人次，女1728人次，年龄最大82岁，最小2岁，平均41岁，手术前发现HBsAg阳性92人次，抗-HCV抗体阳性3人次，抗HIV抗体阳性4人次，梅毒螺旋体抗体阳性0人次。

4项传染性指标检测应用仪器：洗板机，酶标仪、水浴箱、加样器、生物安全柜等检验必须硬件设施。

所用检测试剂分别是：潍坊三维生物工程集团有限公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)，英科新创(厦门)科技有限公司生产的人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒(双抗原夹心酶联免疫法)，上海科华生物技术有限公司生产的梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒(双抗原夹心酶联免疫法)，上海科华生物技术有限公司生产的丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)，在有效期限内使用，严格按操作说明书操作。所有操作一律按仪器说明书和项目检测规程，认真操作。对阳性检测结果进行复核并双人签字，向上级医师汇报，做备案登记。

2、4项传染性指标检测方法原理

HBsAg检测是在微孔板条上预包被纯化乙肝表面抗体，配以酶标记抗体及TMB等其他试剂，采用夹击心法原理检测

人血清原理检测人血清或血浆中的乙肝表面抗原。

抗-HIV抗体检测是采用双抗原夹心两步法检测人血清或血浆样本中的(HIV1/2)型抗体。采用多种HIV-1和HIV-2的特异性抗原制作预包被板及酶结合物。当待检样本中存在HIV抗体时，在反应过程中形成“固相HIV抗原-HIV抗体-酶标记HIV抗原”的免疫复合物，加入底物后形成显色反应。

抗-HCV抗体的检测所用包被抗原为合成多肽抗原和基因工程抗原(包括HCV病毒结构区核心抗原和非结构区抗原)。待测样本加入已包被抗原的反应孔内孵育，若标本中含有抗-HCV抗体，则该抗体与微孔内抗原形成抗原抗体复合物，加入酶结合物，经孵育后，酶结合物连接至抗原抗体复合物上，在TMB底物参与反应的情况下，产生显色反应。

梅毒螺旋体抗体的检测用梅毒螺旋体基因工程混合抗原(17kDa、47kDa)包被的微孔反应板和混合酶标记基因工程抗原(17kDa、47kDa)及其他他试剂制成，应用一步双抗原夹心法原理(ELISA)检测人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体。

3、操作中注意事项

3．1从冷藏环境中取出的所用试剂及待测样本均在室温平衡30min再检测。

3．2检测中样品加样均用经常校对准确性的微量加样。

3．3洗涤时要充分，各孔均加满，防止孔口内游离酶不能洗净影响吸光值，出现假阳性和假阴性。

3．4所用试剂盒、样本和废弃物均视为有传染性物质,严格按照传染病实验室检查规程处理。