抗体范文10篇

抗体范文篇1

论文摘要：介绍了卵黄体抗研究的历程和较其他抗体的优越性，阐述了卵黄抗体在治疗仔猪腹泻上的研究与应用。

1卵黄抗体研究历程

卵黄抗体的研究始于19世纪末至20世纪初。1889年，Klemperer发现了卵黄中富含抗体。1934年，Jukes的试验证明，母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中，从而为雏鸡提供被动免疫保护。Patterson等（1962）试验证实，相对于别的血浆蛋白，IgG被选择性地转运到卵泡中。1969年，Leslie和Clem将这种抗体命名为IgY。Roth等（1981）和Locken等（1983）提出并证实IgY转运到卵泡的过程是受体依赖性的，认为卵巢的IgY受体使得血液中所有的IgY亚群被选择性转运到卵泡中。存在于禽卵黄中的免疫球蛋白主要是IgY，IgM、IgA和IgD含量极少。

鸡IgY在功能上相当于哺乳动物IgG，但在结构上有所不同。相对于哺乳动物IgG，鸡IgY也是由2条轻链和2条重链组成，但IgY重链没有铰链区，除可变区外，有4个恒定区。Warr等（1995）利用序列比较表明，鸡IgY重链可变区Cv3、Cv4相当于哺乳动物IgG重链可变区Cy2、Cy3，而鸡IgY重链可变区Cv2在哺乳动物IgG重链中被铰链区取代。序列比较分析同样发现，相对于其他免疫球蛋白IgG、IgM和IgA，鸡IgY与哺乳动物IgE在系统发生学上更接近一些。鸡IgY可分为IgY1、IgY2和IgY33个亚类，但卵黄中只有IgY1和IgY22种。

2卵黄抗体的优越性

（1）由于鸟类与哺乳类动物种系发生学的差距，鸟类更适于生产抗哺乳动物抗原的特异性抗体。卵黄抗体不会激发补体系统，不与抗哺乳动物抗原的抗体发生反应，不与哺乳动物和细菌的Fc受体结合，这在免疫诊断中具有重要意义（Lindmark等，1983；Guss等，1986；Boscato等，1988；Kapyaho等，1989；Larsson等，1990；Lindahl等，1992）。

（2）化学性质稳定。卵黄抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白，在贮存、生产、加工、摄食及消化过程中保证其稳定性是非常关键的。多项试验表明，鸡IgY具有较好的稳定性，耐酸、耐碱、耐热（Shimizu等，1992，1993；王炯等，1997；龙中儿等，1997；郭立君等，2001）。李春晖等（2002）研究了胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY活性的影响，结果表明：IgY经胃蛋白酶酶解24h后仍保持中和抗原的作用，其酶解片段也具有抗体活性。Hatta等（1993）研究了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对抗人轮状病毒IgY活性的影响，结果表明：在pH2.0条件下，抗人轮状病毒IgY在胃蛋白酶处理1h后活性几乎全部丧失；但在pH4.0条件下的活性为91%，10h后仍有63%的活性；而胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对抗人轮状病毒IgY活性的影响不大。李学伍等（2000）试验表明，胃液对干粉抗体效价影响不大。特别对幼龄动物而言，其胃内pH值不是很低的情况下，口服卵黄抗体不会遭到太大的破坏。Hatta等（1994）用体内试验研究了鳗鱼胃肠环境对卵黄抗体的影响，结果表明：口服抗体7h后在鳗鱼肠内容物中仍可检测得到高水平的抗体活性。此外，卵黄抗体还具有良好的加工和贮存性能。李学伍等（2000）将抗仔猪大肠杆菌卵黄抗体制成喷雾干燥粉，除了黏附在管壁上的抗体滴度稍有下降外，正常喷出的干粉抗体滴度与卵黄液一致。体外试验表明，经喷雾干燥的含抗K88黏附素抗体的鸡卵黄粉能有效阻碍ETECK88与猪小肠黏膜的黏附（Jin等，1998）。卵黄抗体较易保存，4℃条件下存放5年或室温条件下存放6个月对抗体活性无明显影响（Larsson等，1993）。王炯等（1997）报道，抗脊髓灰质炎病毒IgY在25℃室温条件下保存半年，活性无明显变化。

（3）产量高，成本低，便于规模化生产。卵黄中抗体浓度能长期维持在相当于甚至超过血清抗体浓度的水平上（BarJoseph，1980；Larsson等，1993；Hatta等，1993）。1只产蛋鸡（以平均每周产蛋5~6枚，平均每枚鸡蛋蛋黄大约15mL计算）所产蛋生产的抗体量相当于90~100mL血清或180~200mL血液中抗体的量，例如1只兔子1个月可提取IgG约200mg，而1个月1只蛋鸡可从蛋中提取IgG2000mg以上。此外，在实际生产中，动物的采血不仅对动物本身是极大的应激，而且费时、费工，大规模生产是不切实际的，而利用蛋鸡生产抗体要方便的多。

3卵黄抗体的应用

在现代规模化养猪生产中，特别是大规模、高密度饲养方式下，仔猪腹泻是困扰养猪业的主要难题之一，给养猪业带来了巨大的经济损失。其中产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是导致规模化猪场仔猪腹泻的最主要的致病性大肠杆菌。ETEC感染性腹泻主要发生于集约化养猪场及种猪场，个体饲养的猪虽然也有发生，但较少见。无明显季节性，低温潮湿和寒冷季节多发。

生产上多采用ETEC的多价疫苗免疫母猪，提高初乳中的抗体水平，以防治哺乳仔猪ETEC感染性腹泻；但母乳中的抗体保护作用是有限和暂时的，在断奶后短期内将消失，而高免血清价格昂贵。因此，应用抗ETEC卵黄抗体治疗和预防新生和断奶仔猪腹泻的研究在国内外一直备受瞩目。

在卵黄抗体的研究中，国内外所用方法不尽一致，国内多采用大肠杆菌菌苗免疫母鸡，国外则采用大肠杆菌黏附素免疫。由于抗黏附素卵黄抗体在特异性、效果等方面优于抗菌体卵黄抗体（肖驰等，1998；Marquardt等，1999）。近年来，应用抗黏附素抗原特异性卵黄抗体预防和治疗仔猪腹泻已经取得了较大进展（Yokoyama等，1992；Erhard等，1996；Imberechts，1997；Marquardt等，1999）。Yokoyama等（1992）首次进行用卵黄抗体控制仔猪大肠杆菌病，他们将提纯的ETECK88、K99和987P黏附素制成黏附素蛋白疫苗，胸部肌肉注射免疫产蛋母鸡，抗体水平达到高效价后，收集鸡蛋，分离和喷雾干燥卵黄抗体，对感染不同ETEC菌株的初生未食乳仔猪进行卵黄抗体治疗，结果显示，所有仔猪接受不同菌株感染后12h内均发生腹泻；用效价为625和2500的抗体治疗仔猪全部存活，而对照组仔猪死亡率超过80%。Erhard等（1996）、Zuniga等（1997）、Imberechts等（1997）和Marquardt等（1999）都进行了相关的研究，均得到了类似的结论。肖驰等（1998）分别制备了抗K88、K99、987p和F41菌毛抗原和菌体抗原卵黄抗体，结果表明，用菌毛蛋白疫苗得到的抗体甘露糖血凝抑制（MRHI）效价要高于菌体疫苗，前者防治仔猪腹泻效果也明显好于后者。Marquardt等（1999）报道，用菌毛蛋白疫苗免疫的抗体滴度为140000，而全菌体疫苗抗体滴度仅12000。

4参考文献

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抗体范文篇2

单链抗体除本身的治疗作用外，还可作为载体与细胞因子等结合，构建成双功能抗体用于肿瘤的导像治疗。据文献报道［1~3］各衍生因子两个完整基因融合成单一蛋白，经抗肿瘤活性检测发现，融合蛋白具有双重活性，但融合蛋白的亲和性及抗肿瘤活性分别较衍生因子的功能及活性有所变化，可能由于融合蛋白结构变化导致功能及活性的变化。利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质，为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据。

1双功能抗体的研究进展

随着分子生物学的发展，肿瘤的药敏基因治疗成为各国学者研究的热点［3~5］。将目的基因导入靶细胞是基因治疗过程中的一个重要环节，因为目的基因导入靶细胞效率的高低将直接影响基因治疗的效果甚至成败。由逆转录病毒介导的基因转移所面临的最大问题是病毒转导效率较低，原因之一是由于包装后难以得到稳定产生较高滴度感染性逆转录病毒的包装细胞系。单链抗体（ScFv）是由Fv抗体衍生而来，将抗体重链可变区和轻链可变区通过一段连接肽连接而成，ScFv具有天然抗体的亲和力，而分子只有完整抗体的六分之一。具有分子小、穿透力强、容易进入实体瘤周围的血液循环等特点，体内应用具有较大的分布容积和较高的组织分布比例，ScFv是构建双功能抗体，双特异性抗体等多种新功能抗体分子的理想元件。一个蛋白或蛋白片段可以融合到ScFv片段上以配备附加的性质，如免疫毒素的产生，是通过将一个肿瘤特异的ScFv或Fab融合到一个内源化能杀死靶细胞的毒素上。许多细胞特异抗体可将试剂传递到肿瘤部位发挥其细胞毒元件的作用。肿瘤特异性抗体片段已经与细胞因子融合［4~8］。在这种情况下，称免疫细胞因子的分子注射到患者体内，在肿瘤细胞表面积聚，可以激活肿瘤附近的T淋巴细胞。这些融合蛋白内在的肿瘤结合活性允许使用低浓度，没有通常与系统细胞因子注射相关的副作用。

细胞因子融合蛋白均具有衍生因子的双重活性，其中有一些的活性较各自野生型低，或者与野生型因子的相加一致，或者其活性高于衍生因子的相加活性，人工构建的新蛋白可能具有与衍生因子无关的新活性［9~11］。事实证明：具有不同功能域的复合蛋白质以及连接肽的设计是今后寻找新的治疗因子的有效途径和研究方向。生物信息学可以促进药物的发现和开发过程，即充分利用生物信息学的生物学和遗传学信息来寻找和开发以基因为基础的药物。

2双功能抗体的表达及其生物学性质的预测

对于cDNA序列包含一个完整的蛋白质编码区，重要的则是分析所编码蛋白质的功能。蛋白质序列的生物信息学分析是从理论分析迈向实验研究的最为重要的部分。如果拟对所感兴趣的基因投入实验研究，那么，基于生物信息学获得尽可能多的关于该基因/蛋白质的信息是十分重要和极其重要的，尤其是当采用生物信息学的分析得到其结构功能域的信息后，将对研究思路的制定提供重要的指导信息［12，13］。

传统生物学认为，蛋白质的序列决定了它的结构，也就决定了它的功能［14，15］。因此，随着近10年来生物学分子序列信息的爆炸性增长，大大促进了各种序列分析和预测技术的发展，目前已经可以用理论预测的方法获得大量的结构和功能信息，用生物信息学的方法，通过计算机模拟和计算来“预测”出未知蛋白质信息或提供与之相关的辅助信息，可以用较低的成本和较快的时间就能获得可靠的结果［16~18］。重组融合蛋白是通过DNA重组的方法，将功能上相关的两种蛋白用连接肽连接，以达到优化蛋白功能的目的，如免疫毒素和细胞因子融合蛋白，并已用于肿瘤治疗。我们在构建融合蛋白之后，运用生物信息学资源DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-TNF-αDNA序列翻译并获得了氨基酸序列，蛋白质分析软件（ANTHEPROTV5）分析融合蛋白的二级结构及其理化性质。利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质，为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据。构建重组导向的融合蛋白［19］，通过重组PCR方法在编码ScFv与TNF-α的碱基之间引入酶切位点，并克隆到逆转录病毒表达载体PLxSN上表达，用脂质体转染法转染PA317包装细胞，G418筛选10天后共挑选50个细胞集落，扩大培养后测定29个细胞集落的病毒滴度，筛选出一株cfu>1×109/L的感染性重组病毒产生细胞系C26。【参考文献】

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12张成岗，贺福初.生物信息学方法与实践.北京：科学出版社，2002，126-136.

13黄韧，薛成.生物信息学网络资源与应用.广州：中山大学出版社，2003，237-306.

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抗体范文篇3

【关键词】艾滋病;人类免疫缺陷病毒;酶联免疫吸附试验;胶体金法;蛋白印迹;诊断效能;一致性

艾滋病（AIDS）作为一种免疫性疾病，具有较强的传播性，多由于人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）经血液途径、性接触途径及母婴途径等感染所致，若未能及时诊断并治疗会破坏人体免疫系统，造成患者反复感染，威胁生命安全。随着我国AIDS从局部暴发到广泛流行，其防治策略也逐渐从道德宣传和出入境防范转变为主动对公众进行AIDS知识的宣传教育，各级地方政府、人民医院、学校都参与到AIDS防治的宣传教育中。加强HIV抗体检测，有利于及时发现HIV病毒并对其传播进行阻断[1，2]。酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）、胶体金法为筛查HIV抗体的重要方法，但目前何种方法检测结果更为准确尚无确切结论[3，4]。本研究探讨ELISA测定HIV抗体对AIDS的诊断价值，并与胶体金法诊断HIV抗体结果进行比较，从而实现AIDS早发现、早诊断、早治疗，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2019年1月—12月于深圳市龙岗区第三人民医院治疗的AIDS高危人群或疑似HIV感染患者1820例。其中男943例、女877例；年龄28~59岁，平均年龄（42.19±3.26）岁；体质量指数（bodymassindex，BMI）18.2~29.7kg/m2，平均（23.49±1.56）kg/m2；受教育程度：小学及以下、初中、高中、高中以上各有459例、318例、586例、457例；婚姻状况：未婚、再婚、离异/丧偶各有906例、893例、21例；职业：无工作、有工作各有146例、1674例；性取向：男男性行为、异性性行为各有820例、1000例。

1.2入选标准

纳入标准：①依从性较高，能够积极配合临床诊治，未患有精神疾病，理解及认知功能正常；②患者均进行ELISA、胶体金法检查HIV抗体。排除标准：①存在严重机体感染；②合并恶性肿瘤；③肝、肾功能不全；④已确诊为HIV感染者或者确诊为AIDS患者。

1.3方法

1.3.1仪器及试剂全自动酶免仪（AE115）由深圳市爱康生物科技有限公司提供，仪器性能良好，均经过校准；ELISA试剂、胶体金试剂分别由珠海丽珠试剂有限公司、广州万孚生物技术股份有限公司提供，所有试剂均在有效期范围内使用。1.3.2检测方法采集患者清晨空腹静脉血6mL，3000转/min离心10min，离心后取上清液，采用胶体金法、ELISA测定检测HIV抗体。胶体金法检测时取待测样本50μL分别加于试纸板条加样区，将1滴稀释液加在加样区上方，于30min内观察并记录结果。ELISA采用常规操作进行检测，严格依据试剂盒说明书完成各项操作过程，初筛阳性标本进行双孔复试。

1.4评价指标

①记录胶体金法、ELISA诊断HIV抗体结果。②以蛋白印迹诊断HIV抗体结果作为金标准，计算胶体金法、ELISA诊断HIV抗体敏感度、特异度、准确率、阴性预测值、阳性预测值。③计算胶体金法、ELISA诊断HIV抗体结果与蛋白印迹诊断结果的一致性。

1.5统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件分析数据，计数资料以%表示，采用χ2检验，一致性采用Kappa检验（Kappa>0.75表明一致性极好，0.4~0.75表明一致性较为理想，<0.4表明一致性差），P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1蛋白印迹诊断结果

1820例患者经蛋白印迹证实阳性、阴性各有21例、1799例。

2.2胶体金法、ELISA诊断

HIV抗体结果胶体金法诊断HIV抗体阳性、阴性各有372例、1448例，其中漏诊7例，误诊358例；ELISA诊断HIV抗体阳性、阴性各有56例、1764例，其中漏诊1例，误诊36例；以蛋白印迹诊断结果作为金标准，ELISA诊断HIV抗体敏感度、特异度、准确率、阴性预测值、阳性预测值高于胶体金法，有统计学差异（P<0.05）。见表1、表2。

2.3胶体金法、ELISA诊断

HIV抗体结果与蛋白印迹诊断结果的一致性分析胶体金法诊断HIV抗体结果与蛋白印迹诊断结果的一致性差（Kappa=0.051，P=0.000）；ELISA诊断HIV抗体结果与蛋白印迹诊断结果的一致性较为理想（Kappa=0.511，P<0.001）。

3讨论

抗体范文篇4

天疱疮是累及皮肤黏膜的一种自身免疫性大疱性疾病。目前已证实天疱疮是以患者体内出现针对自身表皮角质形成细胞上的桥粒芯糖蛋白（dcsnoglein,Dsg)的特异性抗体IgG，能与角质形成细胞结合产生棘层松解，导致临床上所见的松弛性水疱和大疱，其中Dsg1、Dsg3及其抗体在天疱疮中发挥极其重要的作用。本文就抗原抗体及其临床意义作一综述。

1抗原抗体

1.1抗原现已明确天疱疮抗原Dsg属于桥粒的跨膜成分,属粘附分子中的钙粘素超家族的成员,其基因位于18q12.1上。Dsg分为Dsg1、Dsg2、Dsg3三类，其中Dsg2表达于所有的桥粒组织中，Dsg1、Dsg3主要限于复层鳞状上皮。Dsg1分子量约160KD，主要分布于表皮上层的角质细胞膜上，以颗粒层和颗粒下层优势表达［1］，为落叶性天疱疮（PF）的靶抗原；Dsg3的分子量约为130KD，主要分布于表皮基底层，在基底层上层的角质形成细胞表面，是寻常性天疱疮（PV）的靶抗原。杨春俊等［2］在天疱疮抗原的定位研究中，用金标记包埋后采用免疫荧光技术，发现PF和PV的靶抗原在角质形成细胞间的部位相同，均位于桥粒复合体上。Dsg1及Dsg3分子同其他钙粘素分子一样具有5个串联重复、大小大致相等的胞外结构域（extracellulardomain,EC)，其中ECⅠ对应胞外氨基端残基，EC5位于羟基端。Dsg1及Dsg3的不同主要在于Dsg1的1～4胞外结构域具有同源性，Dsg3的5个胞外结构域均具有同源性。

天疱疮抗原的5个胞外结构域中，EC0、EC2、EC4之间具有相对较大的同源性，能被天疱疮患者的血浆特异性识别，因此，这些表位被称为“免疫优势表位”或“致病性表位”，特异性的识别该表位的抗体被称为“致病性抗体”，其中EC1-2及EC3-4具有抗原特异性，与天疱疮抗体具有高度的亲和力，从而为天疱疮的血清学诊断与鉴别提供了新的途径［3］。

1.2抗体天疱疮抗体（PAb)是天疱疮发病的关键因素。1964年Beumer等证实在天疱疮病人的血清中存在抗鳞状上皮的细胞间抗体，并且发现在天疱疮皮损的边缘有免疫球蛋白和补体沉积。最近，Amagai［4］用ELISA方法，通过重组Dsg1、Dsg3，发现天疱疮的临床表现是由患者体内抗桥粒芯蛋白自身抗体的类型所决定。且国内外多数研究认为寻常性天疱疮中天疱疮抗体IgG4是其发病中的重要致病性抗体亚类。国内李逾等［5］为研究天疱疮抗体（PAb）各亚类在致病中的作用，在培养的组织中加入纯化的天疱疮抗体IgG1～IgG4，免疫荧光检查发现IgG4的荧光最强，其次为IgG3、IgG1、IgG2，说明IgG4与抗原有较强的亲和力。而当各亚型浓度相同时，致培养表皮细胞棘层松解程度相同。另外，在培养的表皮细胞中加入天疱疮抗体继续培养24h，细胞的整体外观无明显变化，48～72h，细胞间隙渐增宽，细胞出现松解和小水疱。由此奠定了天疱疮抗体在天疱疮发病中的重要地位。

2抗原抗体的致病机制

Morioka等认为天疱疮患者发生棘层松解可能通过角质形成细胞释放蛋白酶，如纤溶酶原激活物，尤其是尿激酶型纤溶酶原激活剂（upA）破坏细胞间的粘附作用，天疱疮抗体与抗原的结合作为一信号，传递至细胞内部，角质形成细胞产生蛋白溶解酶，被激活的蛋白酶溶解细胞间粘着性连接结构和细胞粘附分子，使表皮细胞相互分离。McNeill等证实表皮角朊细胞表面有高亲和力的upA的受体［6］。而只有upA的受体结合upA才有活性。落叶性天疱疮抗体与上棘层细胞结合后，上棘层细胞分泌位于细胞膜上的upA，溶解细胞周围的粘附分子，引起上棘层的棘层松解；同样，寻常性天疱疮引起下棘层的棘层松解。角朊细胞还分泌纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）。PAI在调节PA功能方面起重要作用，另外PA产生于角朊细胞但不包含在溶酶体内，不会引起较为广泛的破坏。

近年来，钙离子在天疱疮发病机制中的作用受到许多学者的重视。Memar等［7］在实验中发现天疱疮抗原可能通过调节细胞内钙离子移动信号的改变诱导细胞内钙离子暂时性的增加，随之角质形成细胞释放蛋白酶，进一步诱导水疱形成，这种钙离子流可被天疱疮抗体的预吸附所抑制抗体。

3天疱疮抗体Pab的检测

免疫荧光已成为诊断天疱疮的常用方法。临床常用间接免疫荧光（IIF）和直接免疫荧光（DIF）。其最可靠的诊断依据是表皮细胞间IgG和C3的沉积。Helander等对未经选择的黏膜标本进行直接免疫荧光检查，发现直接免疫荧光对诊断天疮疱的价值优于组织病理。天疱疮活动期IIF检测血清Pab阳性率更高。IIF和DIF对照检查，发现DIF阳性率较IIF更高，且持续时间较长，因此确定诊断时宜选用DIF。且发现天疱疮活动期不同部位的“正常”皮肤DIF检测均为阳性，因而认为不一定在皮损边缘部位取材，但是皮损边缘皮肤荧光抗体稀释度较“正常”部位为高。另外，由于低滴度的天疱疮样抗体的存在，国外学者定天疱疮抗体滴度1：50以上为阳性，国内一般定为1：40以上。

Wilson等认为天疱疮皮损好发于头皮部，可能是由于头皮部的靶抗原分布较多，因此检测患者头皮毛囊天疱疮抗体的沉积情况，可能有助于天疱疮的诊断。李晓东等［8］用直接免疫荧光方法测定了21例天疱疮患者拔出的头发上残留毛囊中和皮损处天疱疮抗体的沉积，认为皮肤、毛发切片和拔发直接染色三者的结果一致，但直接染色拔出毛发的方法简单、快速（1～2h）的优点。免疫印记技术是近20年发展起来的一项免疫学检测技术，它不但特异性强且敏感性高，国外已用于PV抗体的检测中。耿龙等［9］应用免疫印记技术检测天疱疮抗体，认为其敏感性稍高于免疫荧光，为天疱疮的诊断提供重要的依据。

随着检验技术的发展，抗独特型抗体已广泛应运于多种自身免疫性疾病的诊断和实验性治疗。石磊等［10］用酶联免疫吸附试验检测49例天疱疮患者，敏感性和特异性达80%以上，高于免疫荧光，认为相对免疫荧光，酶联免疫吸附试验是一种简便、敏感和特异性高的天疱疮血清学诊断方法，并能辅助鉴别PV和PF。而免疫荧光需一定的仪器设备，在基层医院较难开展，影响实验的因素较多，结果的判定有一定的主观性；实验结果是一系列的抗体滴度，不能区分Dsg1、Dsg3的特异性抗体。

4天疱疮抗体的临床意义

赵永铿等［11］在不同部位天疱疮抗体滴度的研究中发现，皮损边缘部位直接免疫荧光阳性时抗体滴度较其他部位“正常”皮肤滴度高，而皮损边缘的“正常”皮肤是皮损不断向外扩展之处，说明抗原抗体反应达到一定程度才会产生皮损。

抗体对桥粒的影响：聂祝湘等［12］建立了棘层松解模型，发现在加入天疱疮抗体后，24h仅引起细胞间隙增宽，48h引起部分桥粒的破坏，72h可致胞膜变平滑，桥粒消失。

一般认为血清中天疱疮抗体的稀释度与病情的严重程度相平行。病情严重、范围广的滴度较高，而病情较轻、范围较小的滴度较低。天疱疮抗体滴度可作为临床观察和治疗的指标。

在皮质类固醇激素治疗天疱疮中发现，皮质类固醇激素的应用，患者的临床症状明显改善，天疱疮抗体滴度也随着降低，但是，Judd等［13］发现天疱疮抗体滴度降低的速度明显落后于临床症状的改善速度。这表明：在皮质类固醇激素开始治疗和天疱疮抗体的滴度降低之间，有一个延滞期，这个延滞期比皮质类固醇激素开始治疗与临床皮疹开始改善之间的时间长。因此，顾富祥等［14］认为用皮质类固醇激素使用的开始剂量，不应使用抗体的滴度作指标，而应根据患者的皮损的严重程度和治疗的反应决定；但在决定皮质类固醇激素治疗的期限长短时，不应只根据临床症状的改善，而应根据血清循环抗体的滴度，来决定是否减少激素的剂量或停药。

【参考文献】

1HuntDM,SahotaVK,TaylorK,etal.Clusteredcadheringenes:asequence-readycontigforthedesmosomalcadherinlocusonhumanchromosome18.Genomics,1999,62(3):445-455.

2杨春俊，张学军，杨森，等.天疱疮抗体结合靶抗原的定位研究.中华皮肤科杂志，1999，32：381-382.

3翟志芳，刁庆春.天疱疮抗原的研究进展.国外医学·皮肤性病学分册，2004，30：72-74.

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5李渝，刁庆春，王鲁，等.天疱疮抗体亚类在天疱疮发病中的作用.中华皮肤科杂志，2000，33：219-221.

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9耿龙，刘海军，梁再赋，等.应用免疫印记技术检测天疱疮抗体方法的建立.中国微生物和免疫学杂志，2001，21：105-107.

10石磊，张福仁，周桂枝.酶联免疫吸附实验检测血清天疱疮抗体的评价.中华皮肤科杂志，2004，37：83-85.

11赵永铿，罗瑞园，林页新.天疱疮患者不同部位皮肤及不同稀释度荧光抗体直接免疫荧光检查的对照研究.中华皮肤科杂志，1989，23：328-329.

12聂祝湘，刘荣卿，叶庆和.天疱疮抗体桥粒影响的动态观察.中华医学杂志，1996，76：691-693.

抗体范文篇5

关键词nNOS特异性抗体重组表达肌肉

RecombinantexpressionofnNOSfragmentinE.coliandpreparationofspecificantibodyagainstnNOS

CHENQiang,ZHUMin-Sheng,SHENYueetal.

NanjingMilitaryInstituteofMedicalScience,Nanjing210002

AbstractObjective：TopreparethespecificantibodyagainstnNOS.Methods：Clonedagenefragmentcoding708to881aaofnNOSwithPCRandinsertedthefragmentintoapET28aexpressionvector.Results:RecombinantproteinwasexpressedeffectivelyinE.coliandpurifiedwithHisTag-Sepharoseandelectrophoresis.Usingthepureproteinasantigen,immunizedrabbitsandobtainedhighspecificandhightiter(1∶8000)antibodyagainstnNOS.WesternblotassayshowedthatnNOSexpressedinnormalskeletalmuscleismuchhigherthanthatinDMDskeletalmuscle.Conclusion:Theanti-nNOSantibodywithagoodspecificitywaspreparedandtheantibodywasusefulforimmunologicaldetecteionofnNOS

KeywordsnNOSSpecificantibodyRecombinantexpressionSkeletalmuscle

一氧化氮合酶(NOS)有3种同工酶，即诱生型(iNOS)、内皮细胞型(eNOS)和脑型(nNOS)，它们均以L-精氨酸(L-Arg)为底物，在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等辅助因子的作用下生成L-胍氨酸和一氧化氮(NO)［1，2］。nNOS主要分布于小脑、骨骼肌、外周氮能神经、交感神经、肾上腺、脊髓的某些区域等部位。nNOS的表达异常与某些疾病密切相关，如神经、肌肉疾病等［3，4］。在nNOS的研究中，特异性抗体是非常重要的研究工具，由于nNOS与其他NOS之间存在有较高的同源性，且分子量较大(160kD)，这就给nNOS抗体的制备带来较大困难。目前国外采用多肽合成的方法成功地制备了nNOS特异性抗体。我们通过基因工程的方法表达了nNOS特异性区域，并制备出了高效价的特异性抗体。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒和菌种pCMV/nNOS质粒，内含大鼠nNOS全长cDNA，由美国德克萨斯大学西南医学中心提供，pET/28a(+)表达载体购自Novegen公司，pGEM/3z质粒购于Promega公司。BL21及JM109宿主菌由本实验室保存。

1.1.2酶和蛋白质及常用试剂各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶等分别购自Boehriger公司、Promega公司、华美生物工程公司。Lambda/Hindlll,pBR322/HinflDNA分子量标准购自Gibco-BRL公司，HisTagTM-Sepharose购自Novegen公司，nNOS抗体(p9203多肽合成法制备的抗体)由美国西南医学中心提供，常用化学剂主要为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1PCR扩增及基因重组技术参考文献［5］。

1.2.2重组蛋白的纯化按Novegen公司的产品说明书进行，经HisTagTM-Sepharose纯化的蛋白再用电泳回收法纯化，参考文献［6］。

1.2.3抗体的制备将2～4mg纯化蛋白与完全弗氏佐剂混匀，充分乳化，接种至新西兰大耳兔足蹼，2w后加强免疫1次，1w后追加免疫1次。

1.2.4Westernblot分析参见文献［4］。在检测肌肉样本中的nNOS蛋白时，将新鲜肌肉置于缓冲液A(10mmol/LTrisCl,1mmol/LEDTA/EGTA,0.5mmol/LPMSF)中匀浆，取匀浆液作常规电泳。Duchenne肌营养不良症(DMD)的肌肉标本由南京市儿童医院神经内科提供，正常肌肉由江苏省肿瘤医院提供，mdx小鼠肌肉样品(已处理)由美国西南医学中心提供。

2结果

2.1nNOS(708～881aa)蛋白片段编码基因的克隆及重组表达质粒的构建用特异性引物1∶5′GG-GATCCATATGTCCTTTGAGTACCTAT-3′和引物2∶5′-CGGAATTCTATCAGAACCTCACTAAGG-3′，以pCMV/nNOS质粒为模板，扩增后得到0.6kb的特异性片段，将扩增片段用EcoRI和NdeI双酶切，电泳回收后与相同酶酶切的pET28a表达质粒DNA进行连接反应，经筛选得到重组质粒，命名为pET/nNOS180，其质粒图谱如图1，用不同限制性内切酶进行酶切图谱鉴定，结果证实：插入片段中含有一个BglII位点和两个NcoI位点，与已报道序列完全相符，如图2。

图1pET/nNOS180重组质粒图谱

Fig.1PlasmicmapofpET/nNOS180

图2pET/nNOS180重组质粒的酶切图谱

Fig.2RestrictionmapofpET/nNOS180recombinantplasmid

Note:laneM:lambdaDNA/HindIIImarker;laneA:pET/nNOS180(BglⅡ);laneB:pET/nNOS180(NcoI);laneC:pET/nNOS180(EcoRI/NdeI)；laneD:pET/28a(EcoRI/NdeI)

2.2nNOS蛋白片段的表达和纯化将重组质粒导入BL21宿主菌后，即得到重组工程菌，经IPTG诱导后，可见明显的额外表达带，如图3，重组蛋白约占菌体蛋白的10%～15%，经SDS-PAGE电泳初测分子量为22.000kD，纯蛋白用质量飞行质谱测得分子量为22.364kD，与理论计算值(22.117kD，不考虑蛋白修饰)基本相符。pET28a载体中含有6个连续组氨基酸序列，这样，重组蛋白即可通过金属离子螯合的方法进行快速纯化。我们用Ni离子螯合的方法一次纯化重组蛋白的纯度可达90%以上，如图4。为得到更纯的蛋白作免疫抗原，我们又用电泳回收的方法得到纯度为100%的纯化蛋白(图谱略)［6］。

2.3nNOS特异性抗体的制备及活性鉴定通过3次免疫后获得抗血清，用常规间接ELISA法测得在抗体稀释度分别为：1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000时，OD492nm与空白对照的比值(P/N)分别为9.5、8.5、8.1、5.4、2.6和1.6，抗血清的工作浓度初步可定于1∶8000范围内。

为了观察nNOS抗血清与iNOS和eNOS的交叉反应，我们分别用3种NOS的标准品进行SDS-PAGE电泳、转移和Westernblot分析，结果证实抗血清对iNOS和eNOS无任何交叉反应，如图5。业已证实，正常横纹肌中含有大量的nNOS蛋白，而DMD中含量明显减少［3，4，7］，我们分别用自制抗体(下称抗血清)和多肽法制备的抗体(P9203)对肌肉标本中的nNOS进行了Westernblot分析。结果表明：抗血清的工作浓度为1∶6000时仍可检测到小鼠肌肉中的nNOS蛋白，其阳性条带与P9203的阳性条带相似(图未列出)。用1∶6000的抗血清以相同的Westernblot方法证实正常人肌肉中的nNOS含量明显高于DMD肌肉中的含量，与文献报道完全一致，如图6。

图3nNOS180重组蛋白在大肠杆菌中表达

Fig.3ExpressionofnNOS180inE.coli

Note:laneA:inducedfor0h;laneB:inducedfor1h;laneC:inducedfor2h;laneD:inducedfor3h;laneE:inducedfor4h;laneM:proteinmolecularweightmarker

图4经HisTag-Sepharose纯化nNOS重组蛋白的电泳图谱

Fig.4ElectropheresisfornNOSrecombinantproteinpurifiedbyHisTag-Sepharose

Note:laneAandB:purifiedprotein;laneM:proteinmolecularweightmarker

图5nNOS抗血清与iNOS和eNOS的交叉反应测定

Fig.5Crossreactiondetectionforanti-nNOSantiserumwithiNOSandeNOS

Note:lanen:nNOSstandardprotein;lanei:iNOSstandardprotein;lanee:eNOSstandardprotein

图6nNOS蛋白在DMD肌肉和正常骨骼肌中的表达

Fig.6ExpressionofnNOSproteininDMDandnormalmuscles

Note:laneM:prestainedproteinmolecularweightmarker;lane1:normalmuscles;lane2and3:mdxmousemuscles;lane4and5:DMDmuscles

3讨论

我们通过PCR的方法克隆了nNOS708～881aa片段的编码基因并将之插入pET28a原核表达质粒，成功地在大肠杆菌中进行了高效表达。我们首次以nNOS708～881片段蛋白为抗原，免疫动物后得到高效价和高特异性抗体，采用上述抗体，成功地检测了正常横纹肌和DMD肌肉中nNOS的表达情况。

nNOS的N端与其它类型NOS的N端相比，有一段额外序列，就序列特异性讲，该段蛋白可作为免疫抗原并得到特异性抗体，但nNOS的N端含有GLGF序列能与庞大的GLGF相关蛋白(GAP)呈紧密结合［8，9］，抗原决定簇易被掩盖，影响检测效果。目前国外采用多肽合成的方法，人工合成C端18个氨基酸，以此为抗原制备出特异性抗体。但由于合成肽较小，制备的抗体效价较低(最高为1∶5000)且所含抗原决定簇少，可能会影响检测的灵敏度。本文实验证实，选择nNOS蛋白的中间区域作为免疫抗原即可克服上述缺点，另外，由于nNOS708～881aa位于钙调蛋白(CaM)结合区和FAD结合区之间，是电子传递的重要途径，我们所制备的抗体还可与之结合后并中和nNOS的酶活性(资料未列出)。

朱东亚中国药科大学新药研究中心，南京210005

智刚KimSLauJamesTStullUTSouthwesternMedicalCenteratDallas,TXUSA

作者简介：陈强，男，24岁，硕士生，主要从事生化药理学研究；

指导教师，朱敏生，男，34岁，博士生，副研究员，主要从事分子生物学和分子免疫学研究

作者单位：(南京军区军事医学研究所，南京210002)

4参考文献

1NathanC.Nitricoxideasasecreatoryproductofmammaliamcells.FASEBJ,1992;6:305

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7BredtDS.Targetingnitricoxidetoitstarget.PSEBM,1996;211:41

抗体范文篇6

关键词：冬虫夏草；免疫功能；小鼠

冬虫夏草，始载于《本草纲目拾遗》。因其冬季为虫，夏季为草，故名。为麦角菌科真菌冬虫夏草Cordycepssinensis(Berk.)Sacc，寄生蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。主产于四川阿坝藏族自治州松潘、理县、茂汶羌族自治县、甘孜藏族自治州、德格、道孚、青海玉树、果洛藏族自治州及同德、同仁，云南中甸、德钦、丽江纳西族自治县等地，均为野生。主要功效：益肾补肺，止血化痰，止嗽定喘。本实验主要研究冬虫夏草对抗体形成细胞作用，旨在为冬虫夏草的临床应用提供科学依据。

一、器材与方法

1.1仪器和药物

低温冷冻离心机（Beckman,美国）；美国Multiskan产全自动酶标仪；恒温水浴箱（上海）；电泳仪（上海）；100目不锈钢网。冬虫夏草（购于附属医院中药房），取100g加水1000ml，文火煎煮2h，去渣浓缩为100ml（浓度为100%）备用。

1.2动物及分组

取BALB/C纯系小鼠24只，体重18～22g，雌雄各半，随机分为两组，每组12只，Ⅰ组为生理盐水对照组，Ⅱ组为药物实验组。

1.3方法

Ⅰ组用生理盐水灌胃，1次/d，0.5ml/(次·只)；Ⅱ组用冬虫夏草液灌胃，1次/d，0.5ml/(次·只)，共灌10次。

1.4检测项目

1.4.1定量溶血分光光度测定法（QHS）

本法体外测定B细胞产生分泌抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白量（以OD值表示），其结果可反映机体体液免疫功能。实验第5天分别将5%的绵羊红细胞0.2ml注入各组小鼠腹腔内。第11天颈椎脱臼处死小鼠，常规取脾脏，然后脾细胞计数，调整细胞浓度至1×107/ml，平均每组每只小鼠设3支试管，每管依次加脾细胞悬液，0.2%绵羊红细胞（SRBC），1∶10新鲜豚鼠血清（补体）各1ml混匀。另外分别设补体、脾细胞以及SRBC对照管各3支，置37℃水浴温育1h，2000r/min离心5min。取上清液用96孔细胞培养板于全自动酶标仪450nm波长处测OD值，作为QHS反应值。

1.4.2特异玫瑰花环形成细胞检测（SRFC）

取脾细胞0.1ml（1×107/ml），1%SRFC0.1ml，小牛血清0.1ml，试管内混匀，4℃放置2h，加结晶紫溶液20μl，计数500个淋巴细胞，求出SRFC/106脾细胞的形成率。

1.4.3血清IgG检测

采用对流免疫电泳实验，摘除小鼠眼球取血，分离血清，取不同稀释度血清10μl加入阴极端琼脂板孔中，将琼脂板阳极端孔内加入羊抗鼠IgG(1∶32)10μl，将对流免疫电泳通电30min后观察结果，以血清最高稀释度仍有明显沉淀线为准。结果以稀释度表示。公务员之家

二、结果

2.1冬虫夏草对抗体形成细胞的影响

表1结果显示，用药组可促进抗体细胞形成，与对照组相比有显著性差异（P<0.05）。表1冬虫夏草对抗体形成细胞的影响(略)

2.2冬虫夏草对SRFC的影响

表2结果显示，用药组SRFC产生明显增强，与对照组相比有非常显著性差异（P<0.01）。表2冬虫夏草对SRFC的影响(略)

2.3冬虫夏草对小鼠IgG的影响

表3结果显示，用药组可明显促进IgG产生，与对照组相比有显著性差异（P<0.01）。表3冬虫夏草对小鼠IgG的影响(略)

三、讨论

冬虫夏草是临床上常用的中药。现代药理研究证实，冬虫夏草能显著增加小鼠血清溶菌酶的含量，极显著地提高绵羊红细胞的滴度，也能提高巨噬细胞的吞噬功能，提高淋巴细胞转化率和自然玫瑰花环形成率，且能明显增加血清IgG的含量。尚有抗心肌缺血和心律失常的作用、抗应激作用、抗衰老作用、抗炎作用及抗肾衰作用。本研究重点从细胞及分子水平探讨冬虫夏草对抗体形成细胞，IgG分子的影响。实验证明，冬虫夏草能增强小鼠抗体形成（B细胞）活性，促进B细胞分化、增殖为浆细胞；药物组与对照组相比有显著性差异（P<0.05），冬虫夏草组SRFC数目明显高于对照组，与对照组相比有非常显著性差异（P<0.01），冬虫夏草可使小数血清IgG含量增加，与对照组相比有非常显著性差异（P<0.01）。提示如机体免疫功能下降者可口服冬虫夏草以增强机体免疫功能，预防某些疾病。本实验结果为临床应用冬虫夏草提供了实验依据。

【参考文献】

［1］高学敏.中药学（下册）［M］.北京：人民卫生出版社，2000：1690.

抗体范文篇7

【关键词】肺结核结核抗体测定诊断

一、资料与方法

1.1一般资料：本组病例98例，患者中男性39例，女性59例.年龄在1岁—80岁间。论文百事通其中：1-10岁5例；10-20岁15例；20-40岁32例；40岁以上46例.1-30岁者多为急性起病，30岁后多为慢性起病。

1.2方法

对入院初诊考虑有结核病倾向的患者，入院后即进行结核抗体测定，对结核中毒症状明显但初次测定结核抗体阴性部分患者，于2周和4周后再次测定结核抗体。该组患者入院初诊考虑：肺部感染18例、支气管扩张症13例、浸润性肺结核20例、结核性胸膜炎33例、结核性脑膜炎10例、脊柱结核3例等。

二、结果

98例住院患者血清结核抗体初次测出阳性为53例，2周后测出阳性为64例，4周后测出阳性为70例.接合患者胸部X线及肺部CT、结核菌素试验、胸腔积液测定及临床表现，本组98例入院患者最后诊断：原发性肺结核3例、浸润性肺结核24例，结核性胸膜炎30例、空洞性肺结核10例。陈旧性肺结核5例、围生期心肌病1例、心力衰竭3例、肺部感染9例、支气管扩张症10例、结核性脑膜炎3例。

三、讨论

3.1近年来由于艾滋病的流行与2型糖尿病的上升及耐药结核菌的增加，全球结核病呈明显上升趋势。全球每年有300万人死于结核病，WHO认为控制结核病已是当务之急。但现代结核病症状交叉、隐蔽，导致漏诊、误诊时有出现。临床对肺结核的诊断方法提出更高要求。

常规方法的抗酸染色镜检查抗酸杆菌阳性率低，培养结果虽可靠，但耗时长，需3～8周，且阳性率也低。结核菌素试验的影响因素较多，存在假阴性等问题。

3.2活动性结核病患者细胞免疫减损而体液免疫亢进，血液及其他体液中结核抗体（主要是IgG）升高，应用ELISA检测结核抗体有助于结核病的诊断。结核分枝杆菌的LAM是细胞壁重要组成成分，结核菌的LMA含量比其他分枝杆菌的含量高许多，以分枝杆菌菌壁特有的LAM为抗原，检测体内针对LAM的IgG抗体（LAM-IgG），被认为对活动性结核病的诊断具有快速、简便等特点。但在临床上结核抗体测定也需与临床结合，可有假阴性出现，该组患者中有5例抗酸杆菌痰涂片阳性，但结核抗体初次测定为阴性，经追踪检测后2例转为阳性，仍有3例为阴性结核抗体假阴性考虑与以下因素有关：

3.2.1感染时间短，尚末形成LAM的IgG抗体（LAM-IgG）；

3.2.2免疫损害者：指原发免疫缺陷性疾病及接受放、化疗和免疫抑制药物治疗者；

3.2.3极度免疫功能低下者：常见于老年患者及重度营养不良婴幼儿；本组75岁以上老年患者结核抗体及结核菌素试验（PPD）均为阴性。本组病例中有2例重度营养不良婴幼儿结核抗体一直为阴性，其中一例合并结核性脑膜炎，经抗结核治疗后均好转；

3.2.4获得性免疫缺陷综合症合并结核者，本组病例中收治5例艾滋病合并结核者有4例结核抗体为阴性，4例结核抗体阴性患者有2例酸杆菌痰涂片阳性。追踪复查结核抗体一直为阴性。wWw.gWyoO

3.2.5糖尿病合并肺结核。本组1例2型糖尿病合并结核患者，痰涂片抗酸杆菌阳性，但结核抗体为阴性结核抗体阳性患者也不能就诊断为活动性肺结核，需接合临床及其他相关辅助检查，本组病例中有3例患者结核抗体阳性，但接合胸部平片、肺部CT及临床表现，不考虑活动性结核，予积极抗感染治疗后痊愈。

本组资料显示，结核抗体测定对活动性肺结核诊断具有较高的实用价值，但不能作为诊断标准，仍需密切接合病史、临床表现及相关辅助检查方可明确诊断。

参考文献：

［1］陈健.万康林.杨娟等：结核分枝杆菌基因分型及耐药性分析成都医学院学报2008，3（1）：10-15

抗体范文篇8

BiologicalactivityoftetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigenandCD3molecule

【Abstract】AIM:Tostudythebiologicalactivityoftetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigen(PSA)andCD3molecule.METHODS:Flowcytometry(FCM)wasusedtodetectthebindingactivityofbispecificsinglechainantibodytoCD3positivecelllineJurkatandprostatecarcinomacelllineLNCaP.Theefficacyoftheantibodiyinmediatingtumorcelllysisinvitrowasdeterminedbyusingthe51Crreleasetest.Forinvivoevaluationoftheantibodysactivity,anudemousemodelwasused.ThemicewereinoculatedwithLNCaPprostatecancercells.RESULTS:ItwasdemonstratedthatthetetramerofbispecificsinglechainantibodycouldbindtotheJurkatandLNCaPcellswithhighspecificity.Thepercentsofthecellsbondbytheantibodywere70.4%and81%,respectively.Invitro,withactivatedCTLsaseffectorcells,aspecificlysisofLNCaPcellsmediatedbytheantibodywasconfirmedby51Crreleaseassay.ThespecificlysisrateofLNCaPcellswaspositivelycorrelatedtotBsAbconcentrationoreffector/targetcellratio.Thehighestspecificlysisrateswere(80.3±5.2)%and(78.6±5.5)%infixedantibodyconcentrationgroupandfixedeffector/targetcellratiogroup,respectively.Invivo,theantibodycouldsuppressthetumorgrowthinnudemicesignificantlyascomparedtothegrouptreatedonlywithCTLsandtheuntreatedcontrolgroup(P<0.0001).CONCLUSION:ThetetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigenandCD3moleculehasagoodbiologicalactivityinbindingantigens,mediatinglysisofLNCaPcellsandinhibitingtumorgrowth.

【Keywords】prostaticneoplasms;antigens,CD3;antibodyaffinity;tetramer

【摘要】目的：研究抗前列腺特异抗原(PSA)/抗CD3双特异性单链抗体四聚体的生物活性.方法：利用流式细胞仪和51Cr释放试验评价双特异性单链抗体四聚体的抗原亲和活性和体外介导杀伤靶细胞的效果.利用裸鼠前列腺癌模型分析其在体内介导细胞毒T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤的能力.结果：抗PSA/抗CD3双特异性单链抗体四聚体可以特异性结合表达前列腺癌细胞和CD3阳性的淋巴瘤细胞，阳性结合率分别为70.4%和81%.在体外，有细胞毒T淋巴细胞存在时该四聚体可引起前列腺癌细胞的裂解，在抗体浓度固定组和效应细胞/靶细胞比例固定组，靶细胞裂解率分别随着效应细胞/靶细胞比例和抗体浓度的增加而增加，最高裂解率分别可以达到(80.3±5.2)%和(78.6±5.5)%.与对照组比较，接种前列腺癌细胞的裸鼠在体内注射激活的细胞毒T淋巴细胞的同时接受该四聚体的治疗后，肿瘤生长明显受到抑制(P<0.0001).结论：抗PSA/抗CD3双特异性单链抗体四聚体具有良好的生物学活性，具有体外杀伤肿瘤细胞和体内抑制肿瘤生长的作用.

【关键词】前列腺肿瘤；抗原，CD3；抗体亲和力；四聚体

0引言

免疫治疗因其可以调动机体自身的免疫力，弥补患者免疫系统缺陷，达到治疗肿瘤的目的而成为肿瘤治疗方法中的重要组成部分.其中可以激活细胞毒T淋巴细胞并使其在肿瘤局部聚集的抗CD3/抗肿瘤特异性抗原双特异性抗体倍受研究者瞩目［1］.人p53基因表达产物以四聚体形式存在，其四价功能域表达产物可自动装配成四聚体.我们在成功构建了人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因［2］和制备抗前列腺特异抗原/抗CD3双特异性单链抗体(BsAb)的基础之上［3-4］，将四价功能域融合基因与双特异性单链抗体基因拼接，制备双特异性单链抗体的四聚体［5］，明显提高了双特异性单链抗体的亲和力,改善了其生物活性.

1材料和方法

1.1材料抗PSA/抗人CD3双特异性单链抗体四聚体(tBsAb)［5］由本实验室制备并保存；前列腺癌细胞系LNCaP和CD3阳性的淋巴瘤细胞系Jurkat购买自美国标准培养收集所(ATCC,USA)；健康纯种雌性Balb/c裸鼠（6~9wk）购买自中科院上海实验动物中心.FITC标记的抗myc单克隆抗体(9E10)为第四军医大学免疫教研室谢鑫博士惠赠；其它常规试剂均为进口或国产分析纯.

1.2方法

1.2.1抗体亲和活性的鉴定前列腺癌细胞LNCaP和CD3阳性的淋巴瘤细胞Jurkat分别用含100g/LFCS的RPMI1640调整细胞浓度为5×109～1×1010/L，两种细胞悬液各取2份，40μL/份，分别加入纯化后的抗体（tBsAb），调整抗体终浓度为20mg/L，再加50μL1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清，4℃放置30min，用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2mL，离心1000r/min，5min，弃上清，加入50μL1∶1500的FITC标记的抗myc单克隆抗体，充分振摇，4℃放置30min，用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2mL，离心1000r/min，5min，弃上清，加入1mL固定液，进行流式细胞仪(FCM)检测.用正常鼠IgG替代抗体，按上述方法处理后作为阴性对照.

1.2.2效应细胞的制备利用密度梯度离心方法从正常人肝素化血液中提取外周血单核细胞（PBMC），加入低温PBS重悬浮后，离心1000r/min，10min，弃上清，加入含有100g/LFCS,2mmoL/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640重悬浮.PBMC悬液移入250mL细胞培养瓶，CO2孵箱孵育1d，将非贴壁细胞移入新的培养瓶，更换培养液，并加入终浓度150U/mL的IL2，孵育3d，再次更换培养液，并将IL2的终浓度调整为100U/mL.之后每3d更换培养液，连续培养8wk后做为效应细胞.

1.2.3细胞毒实验利用51Cr释放试验鉴定双特异性抗体介导的效应细胞杀伤肿瘤细胞的效果.靶细胞的标记：将5×106LNCaP细胞和7400kBq（200μCi）Na2［51Cr］O4在37℃的50mL/LCO2孵箱中孵育1d，RPMI1640洗涤2次后，加入96孔培养板中（1×104/孔）.将靶细胞分为对照组和tBsAb组，对照组中应用小鼠IgG.每组再分为抗体浓度固定组和效应细胞/靶细胞比例固定组.另设仅含标记靶细胞的自然释放对照孔及含有标记靶细胞和10mL/LTritonX100的最大释放对照孔.抗体浓度固定组的抗体浓度为30μg/L，效应细胞/靶细胞比例从0.5∶1至30∶1不等；效应细胞/靶细胞（E/T）比例固定组中E/T为20∶1，抗体浓度为0.1~300μg/L，相同实验条件重复4孔.50mL/LCO2孵箱，37℃放置4h.然后，经过离心提取培养上清（150μL），γ计数器测量每份上清的cpm值.计算特异性释放率：特异性释放率(%)＝（实验孔cpm-自然释放对照孔cpm）/(最大释放对照孔cpm-实验孔cpm)×100%.

1.2.4裸鼠动物模型四只健康裸鼠静脉注射tBsAb和效应细胞，验证抗体及效应细胞毒副作用.将36只裸鼠随机分成3组：非治疗组、对照组和tBsAb组，非治疗组不接受任何治疗，对照组每日仅接受静脉注射效应细胞（1×107），tBsAb组静脉注射1×107效应细胞和200μgtBsAb.分别于裸鼠腹侧皮下注射1×107LNCaP细胞，等肿瘤体积达到约100mm3时，开始各组治疗方案并计时，肿瘤体积每周测量1次，体积计算：宽2×长×0.52.6wk后将裸鼠用CO2处死.

统计学处理：利用SAS8.1统计软件分析,统计图利用SPSS13.0制作，采用重复测量方差分析.P<0.05为具有统计学意义.

2结果

2.1流式细胞仪FMC显示双特异性抗体四聚体可以特异性结合前列腺癌细胞LNCaP和CD3阳性的淋巴瘤细胞Jurkat，与LNCaP细胞和Jurkat细胞的阳性结合率分别为70.4%和81%(图1).

A:Jurkat细胞阴性对照组;B:tBsAb与Jurkat细胞的结合；C:LNCaP细胞阴性对照组;D:tBsAb与LNCaP细胞的结合.

图1FCM分析tBsAb分别与LNCaP和Jurkat的结合活性（略）

2.2体外介导的细胞毒作用tBsAb可以有效的介导效应细胞（T细胞）对靶细胞（LNCaP细胞）的杀伤，靶细胞裂解百分比在实验组（效应细胞/靶细胞比例固定组和抗体浓度固定组）和对照组之间的差异均具有统计学意义（P<0.0001）.在效应细胞/靶细胞比例固定组，随着tBsAb浓度的不断增加，特异性释放率显著增加（P<0.0001）；同样，在抗体浓度固定组，随着效应细胞/靶细胞比例的逐渐增加，特异性释放率显著增加P<0.0001,图2).

A:效应细胞与靶细胞比例固定组;B:抗体浓度固定组.

图2tBsAb介导的特异性杀伤（略）

2.3裸鼠动物模型4只接受静脉注射tBsAb和效应细胞的健康裸鼠无明显异常表现，证实tBsAb和效应细胞无明显毒副作用，裸鼠可以耐受.36只入组裸鼠中，共33只完成6wk治疗，3只死亡，其中1只死于感染，2只死亡原因不明，将死亡裸鼠实验资料剔除，最终每组实验裸鼠数目为非治疗组（n=12），对照组（n=11）和tBsAb组（n=10）.重复测量方差分析结果显示：非治疗组和对照组肿瘤体积逐渐增大，tBsAb组肿瘤生长明显受到抑制，三组之间差异具有统计学意义（P<0.0001，图3).

图3tBsAb的治疗作用（略）

3讨论

免疫治疗因其可以调动机体自身的免疫力，弥补患者免疫系统缺陷，达到治疗肿瘤的目的而成为肿瘤治疗方法中的重要组成部分.近年来，越来越多的研究结果显示：肿瘤免疫治疗是一种具有广阔应用前景的治疗方法.由于抗免疫效应细胞表面标志物，如CD3,CD2,CD16和CD64等抗体可以有效激活效应细胞，因此利用同时能识别免疫效应细胞及肿瘤相关抗原的双特异性抗体可以增加肿瘤部位效应细胞的数量并激活效应细胞，使其发挥细胞毒功能.

本实验室利用分子克隆的方法成功构建了抗PSA/抗人CD3双特异性单链抗体，试图增加并活化前列腺癌组织周围的细胞毒T淋巴细胞，介导T淋巴细胞对前列腺癌细胞的杀伤，达到治疗前列腺癌的目的.但是，其亲和力和肿瘤杀伤活性不理想［4］.之后我们利用p53四价功能域可以将P53分子自动组装成四聚体的特性，构建了人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因［2］，将其融合在BsAb基因的3''''端，构建了抗PSA/抗人CD3双特异性单链抗体的四聚体基因，并获得真核表达，明显提高了原双特异性单链抗体的亲和力［5］.

我们研究表明,tBsAb可以特异性识别靶细胞，与靶细胞的亲和力明显高于原双特异性单链抗体（BsAb）.体外杀伤实验结果显示tBsAb可以介导细胞毒T淋巴细胞对靶细胞的杀伤，介导杀伤效率明显优于BsAb［4］.同时，这一结果在裸鼠前列腺癌模型体内实验中得到进一步证实：tBsAb基本可以达到抑制肿瘤生长的目的.当然从实验结果中还可以看出：只有当效应细胞成倍于靶细胞，并且抗体浓度达到一定水平时，抗体介导细胞毒T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力才能得到发挥，并且这种能力的大小与效应细胞/靶细胞比例和抗体浓度程正相关.

【参考文献】

［1］KontermannRE.Recombinantbispecificantibodiesforcancertherapy［J］.ActaPharmacolSin,2005,26(1):1-9.

［2］王栋，王禾，武国军，等.人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因的构建及空间构象分析［J］.细胞与分子免疫学杂志，2001,17(4)：381-383.

［3］武国军，郝晓柯，白玉杰，等.抗人精浆蛋白单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆及序列分析［J］.第四军医大学学报，1998，19(5)：484-487.

抗体范文篇9

PreparationofpolyclonalantibodyagainstStat3anditsapplicationinthediagnosisofbreastcancer

【Abstract】AIM:TopreparerabbitantibodyagainstStat3andanalyzeitsapplicationinthediagnosisofbreastcancer.METHODS:ThemalerabbitswereimmunizedwithrecombinantmouseStat3proteintoprepareantibodyagainstStat3.ThepurityandspecificityoftheantibodywereanalyzedbyWesternBlot.TheexpressionofStat3proteininthe65casesofbreastcancerand30casesofnormalbreasttissuewasdetectedbyimmunohistochemicalstaining.RESULTS:ThetiterofantiStat3antibodyinserumwas>1∶256000(A450=0.40)atthe6thweekaftertheimmunization.BothSDSPAGEandWesternBlotanalysisshowedthattherewasanobviousproteinbandwithMr92000,TheintracytoplasmicexpressionlevelsofStat3proteininthedifferenthistologicalgradingsof65casesofbreastcancershowedsignificantdifference(P<0.05),sodidtheintranuclearexpressionlevels(P<0.05).CONCLUSION:PolyclonalantibodyagainstStat3withhightiterandspecificitycanbepreparedsuccessfully,anditcanbeusedtodetecttheexpressionofStat3proteininbreastcancertissue.

【Keywords】Stat3;antibodies;breastneoplasms;histologicalgrading

【摘要】目的：制备兔抗信号转导与转录激活因子3（Stat3）抗体，分析其在乳腺癌诊断中的价值.方法：应用人工重组小鼠Stat3蛋白，免疫雄性家兔制备抗Stat3抗体；用免疫印迹法分析检测抗Stat3抗体的纯度和特异性；应用免疫组化染色法检测65例乳腺癌和30例正常乳腺组织中Stat3蛋白的表达.结果：用Stat3蛋白免疫家兔被免疫6wk后，其血清中抗Stat3抗体效价>1∶256,000（A450nm=0.40）；SDSPAGE和免疫印迹分析均在分子质量（Mr）92000处有明显的带；65例乳腺癌组织的细胞浆和细胞核中，Stat3蛋白表达量在不同的组织学分级之间有统计学差异(P<0.05).结论：高效价和特异性强的抗Stat3抗体被成功制备.该抗体可用于乳腺癌组织细胞Stat3蛋白表达的检测.

【关键词】信号转导与转录激活因子3；抗体；乳腺肿瘤；组织学分级

0引言

信号转导与转录激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription;Stat3)是一类脱氧核糖核酸结合蛋白，于细胞浆内有少量表达，细胞核内无表达，是信号转导与转录激活因子家族的重要成员之一.

异常的信号转导使Stat3磷酸化而被持续激活，促进细胞的恶性转化［1］和阻断细胞凋亡［2］.Stat3也可以被多种细胞因子、生长因子、非受体酪氨酸激酶、G蛋白等分子激活，将细胞外信号转导至细胞核，激活基因的转录和表达［3］.Stat3表达的变化与肿瘤的发生密切相关，然而，有关Stat3在乳腺癌诊断中的作用还没有详细报道.我们用本室制备的小鼠重组Stat3蛋白，再制备兔抗Stat3抗体，来分析Stat3蛋白在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达，以及在乳腺癌诊断中的价值.

1材料和方法

1.1材料雄性，新西兰兔，体质量3.0kg(河北医科大学动物中心).福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂为美国GibcoRBL产品.HRP标记的羊抗兔IgG和免疫组化显色试剂盒（购自北京中山生物工程公司）.重组小鼠Stat3蛋白由本室和美国MD公司共同制备（蛋白含量1.63g/L，经SDSPAGE分离显示单一条带，Mr为92000）.30例正常乳腺组织来自良性增生和良性腺病的患者，65例乳腺癌组织来自女性乳腺癌患者，年龄(48±15)岁.这些研究对象经冰冻切片和免疫组化同时证实确诊，病理学分级由病理科提供，常规方法做病理切片.

1.2方法

1.2.1免疫动物将Stat3蛋白（0.336g/L）0.2mL与福氏完全佐剂0.5mL混匀后，注射于家兔腹股沟和后脚掌进行初次免疫.14d将同样量的Stat3蛋白与福氏不完全佐剂0.5mL混匀后进行第二次免疫，注射部位同前.28d取Stat3蛋白（0.25g/L）0.15mL用福氏不完全佐剂0.5mL混匀后，于背部皮下多点注射进行最终免疫.42d处死兔子收集全血.其中于初次免疫前取耳静脉血2mL；第1次免疫后12d，第2次免疫后7d，第3次免疫后9,14d分别抽血3mL用于抗体效价测定.

1.2.2抗体效价的检测用0.05mol/LpH9.5CBS稀释Stat3蛋白，用常规方法包被酶标板，ELISA法检测兔血清中抗Stat3抗体的效价.

1.2.3抗体的纯化用330g/L饱和硫酸胺盐析抗血清，离心沉淀后，用生理盐水透析24h，8h换1次生理盐水，将透析液用DEAE32层析柱进行浓缩，收集洗脱液，测A280nm值.

1.2.4抗体纯度和特异性检测将Stat3蛋白进行SDSPAGE分离（分离胶浓度为120g/L）.电泳后，用考马斯亮蓝R250染液染色确认蛋白条带，将分离胶中的蛋白用电泳转移法转移至PVDF膜，PVDF膜用50g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜.洗膜后，与兔抗Stat3抗血清(1∶1000稀释)37℃反应2h；加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5000稀释)，于37℃反应1h，以DAB显色.

1.2.5乳腺组织细胞Stat3表达的检测200309/200403取本院外科65例乳腺癌患者手术切除的乳腺癌组织标本，30例良性增生和良性腺病的乳腺组织进行组织切片.将上述方法制备的兔抗Stat3抗体用PBS做1∶400稀释，按常规SP方法进行乳腺组织免疫组化染色.结果判断标准：按照Laird标准［4］进行，Stat3阳性表达为细胞质呈棕黄色云雾状，细胞核呈棕色颗粒状.每个视野中阳性细胞>50%为强阳性（），5%～50%的为阳性（+），<5%为阴性（-）.Stat3蛋白胞质表达：细胞质呈深棕色云雾状>80%（），细胞质呈棕色云雾状>50%（），细胞质呈棕黄色云雾状>5%～50%（+），细胞质呈淡棕黄色云雾状<5%（-）.Stat3蛋白胞核表达：细胞核呈深棕色颗粒状>80%（），细胞核呈棕色颗粒状>50%（），细胞核呈棕黄色颗粒状>5%～50%（+），细胞核不染色或呈淡棕黄色颗粒状<5%（-）.

统计学处理：免疫组化染色所得结果用SPSS11.5软件分析，统计方法为非参数秩和检验，Spearmans等级相关.P<0.05为有统计学意义.

2结果

2.1兔抗Stat3血清效价基础免疫后2,3,5,6wk分别采取静脉血，间接ELISA法检测抗Stat3抗体的血清效价，分别为1∶6400,1∶32000,1∶240000和>1∶256000(A450nm=0.40).

2.2抗Stat3抗体的特异性和纯度鉴定Stat3蛋白经SDSPAGE分离，用考马斯亮蓝R250染液染色，分离出1条Mr为92000的蛋白条带，大小与Stat3理论值相符（图1中M和1）.将凝胶中的Stat3转移至PVDF膜，用制备好兔抗Stat3抗体进行免疫印迹，也出现Mr为92000左右的带（图1中2），证明此抗体为抗Stat3的特异性抗体.

M:marker;1:Stat3蛋白考马斯亮蓝R250染色；2：Stat3蛋白免疫印迹.

图1兔抗Stat3血清特异性的免疫印迹分析（略）

2.3抗Stat3抗体在乳腺癌诊断中的应用将正常乳腺组织30例和乳腺癌组织65例组织切片进行抗Stat3抗体免疫组化染色（表1，图2），Stat3在正常乳腺组织细胞质中呈淡棕黄色云雾状，胞核不着色.乳腺癌组织在不同组织学分级的细胞质中Stat3蛋白表达量有统计学差异(P<0.05)；细胞核中Stat3蛋白表达在不同组织学分级乳腺癌组织中也有统计学差异(P<0.05).正常乳腺组织细胞质中可见棕黄色雾状着色，胞核不着色（图3A）；在低分化癌细胞质呈棕色云雾状，胞核呈颗粒状深棕色（图3B）；而高分化癌组织的细胞质呈棕黄色云雾状，胞核着色呈棕色颗粒状（图3C）.

表1不同组织学分级的乳腺癌组织中Stat3的表达（略）

图2Stat3蛋白在乳腺癌细胞质（A）和细胞核（B）中的表达量与组织学分级（略）

A：正常乳腺组织；B：Ⅲ级；C：Ⅱ级.

图3Stat3在不同分级乳腺癌组织中表达SP×400（略）

3讨论

Stat3分子由750～795个氨基酸组成，Mr约为92000.编码Stat3的基因在鼠科动物定位于第11号染色体，在人类定位于第17号染色体q21.Stat3在信号转导与转录激活途径中发挥着重要作用，细胞膜上的细胞因子受体及非细胞因子受体与相应配体相结合后，使胞质内的Jauns激酶（JaunsKinase;JAK）处于适当空间位置而相互磷酸化，然后募集Stat3蛋白到胞质区磷酸化激酶的酪氨酸残基上，以激活该蛋白，活化的Stat3形成同源或异源二聚体迅速转位进入细胞核，与其特异的DNA序列结合，启动下游基因的转录［5］.Stat3持续活化可引起急性髓细胞性白血病、磷状细胞癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞异常增生［6-8］.细胞核内Stat3含量的高低标志着该细胞JAkStat途径的持续激活程度，只有激活的Stat3才能从细胞质转入细胞核，参与基因的表达调控［9］.Berclaz等［10］报道，正常人乳腺上皮细胞、肌上皮细胞、纤维母细胞周围的脂肪性乳腺间质等组织，检测到细胞质有微量Stat3的表达；在乳腺癌组织胞质内和胞核，都有非常强的Stat3表达，比正常乳腺组织高出很多倍.信号转导与转录激活可使下游癌基因获得转录活性并表达，最终有可能形成癌症.因此，信号转导与转录激活是疾病（如肿瘤）形成的一个早期事件，Stat3的激活可能发生在疾病进程的早期，检测Stat3蛋白在细胞质、细胞核中的表达量将可能用于乳腺癌的诊断.

本实验结果显示，乳腺癌组织的细胞质Stat3蛋白表达量与组织学分级成正相关，在不同组织学分级的细胞质中Stat3蛋白表达量有显著性差异(P<0.05).乳腺癌组织的细胞核中Stat3蛋白表达量与组织学分级成正相关，Stat3蛋白表达的含量也与组织学分级有显著性差异(P<0.001)，组织学分级越高，细胞分化程度越低，胞核Stat3量越高.当乳腺癌发生时，Stat3的胞浆表达量增高，而胞核Stat3的含量从无到有，即胞核中Stat3蛋白呈阳性，因此Stat3蛋白的过量表达可能在乳腺癌的发生、发展过程中起重要作用.

【参考文献】

［1］BrombergJF,WrzeszczynskaMH,DevganG,etal.Stat3asanoncogene［J］.Cell,1999,98(3):295-303.

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［4］LairdDW,FistourisP,BatistG,etal.Deficiencyofconnexin43gapjunctionsisanindependentmarkerforbreasttumors［J］.CancerRes,1999,59(16):4104-4110.

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［6］SpiekermannK,BiethahnS,WildeS,etal.ConstitutiveactivationofSTATtranscriptionfactorsinacutemyelogenousleukemia［J］.EurJHaematol,2001,67(2):63-71.

［7］GrandisJR,DrenningSD,ZengQ,etal.ConstitutiveactivationofStat3signalingabrogatesapoptosisinsquamouscellcarcinogenesisinvivo［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(8):4227-4232.

［8］GarciaR,BowmanTL,NiuG,etal.ConstitutiveactivationofStat3bytheSrcandJAKtyrosinekinasesparticipatesingrowthregulationofhumanbreastcarcinomacells［J］.Oncogene,2001,20(20):2499-2513.

抗体范文篇10

关键词噬菌体展示技术基因工程抗体乙型肝炎X抗原

Expressionofrecombinantanti-HBxsinglechainphageantibody

ZHOUGe,LIUKang-Da,GONGYietal.

ZhongshanHospital,ShanghaiMedicalUniversity，Shanghai200032

QINHui-Lian,HEXi.

DepartmentofImmunology，ShanghaiMedicalUniversity，Shanghai200032

AbstractObjective:Tostudytheexpressionofrecombinantanti-HBxsinglechainphageantibody.Methods:Theanti-HBxsinglechainphageantibody(pScFv)wasconstructedforthestudyonactiveexpressionofgeneticantibodyinE.coli.Theanit-HBxScFvgenewasrecombinedwithphagemidvector(pCANTAB)andtransferredintohostbacteria.Results:Theanti-HBxpScFvwasinducedwithhelperphageM13KO7.ThesolubleexpressionproductsfusedwithphageminorcoatproteinwassecretedwhichwasdetectedspecificbindingaffinitybyWestern-blotandELISAassay.Conclusion:Thesuccessfulconstructionandexpressionofanti-HBxpScFvmightestablishthemethodfortheactiveselectingandpreparingthespecificantibodiesintheE.coliexpressionsystem.

KeywordsPhagedisplayRecombinantantibodyHBxAg

作为肝癌相关抗体，抗HBx单克隆抗体多年来一直被应用于肝癌实验性治疗和亚临床治疗的研究，并取得了一定的疗效［1］。为了进一步解决单克隆抗体在临床治疗中的HumanAnti-mouseAntibody(HAMA)反应，前期我们构建了原核表达的嵌合抗体和单链抗体［2，3］。虽然采用了金属离子配体螯合纯化技术解决了重组抗体的大量纯化问题，重组抗体的复性问题限制了重组抗体进入实验性研究的进程。本研究试图通过构建噬菌体抗体融合表达载体来解决基因工程抗体可变区的活性原核表达，为基因工程抗体进入实验性导向研究提供基础。

1材料与方法

1.1材料HBx单克隆抗体轻，重链可变区基因由本组克隆制备［3］，单链抗体构建载体pOPE-51及重组HBx抗原为德国癌症中心提供(DKFZ，Heiderberg,Germany)，噬菌体抗体构建载体PCANTAB，由中国科学院，上海生物化学研究所提供，限制性内切酶为Gibco公司产品，PCR扩增及DNA测序试剂为PE公司产品，酶标抗His-tag抗体，酶标抗噬菌体抗体为Pharmica公司产品。

1.2PCR扩增单链抗体基因引物委托中国科学院，上海植物生理研究所合成序列如下：X+：5′-ACACAAGGCCCAGCTGGCCGAGTCAGGAGGAGG-3′；X-：5′-TCAATAGCGGCCGCATGATGGTGATGTATGC-3′。

1.3构建抗HBx单链抗体组氨酸融合表达载体及其表达，鉴定，参见文献［3］。

1.4PCR扩增及电泳纯化HBxScFv/His融合基因片段以HBxpOPE为模板(10ng),PCR扩增引物各50pmol，dNTPs200μmol/L,1×PCRBuffer(KCl50mmol/L,Tris-Cl10mmol/LpH8.3,0.1%明胶)，在100μl的反应体积中加入3U的TaqDNA聚合酶，于94℃45s，52℃15s，72℃45s(PE9600)，共30循环，取5μlPCR产物于琼脂糖电泳鉴定。其余产物经制备型凝胶回收特异性片段(GelpurificationKit,QIAGEN,Germany)于-20℃保存备用。

1.5抗HBx噬菌体抗体的克隆构建见图1。

1.6将构建的pCANT-X转化大肠杆菌TG1，于含2%葡萄糖，100μg/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培养液于30℃振荡培养过夜，提取双链质粒DNA，经酶切鉴定筛选阳性克隆，并测序鉴定［4］。

1.7单链噬菌体抗体的融合表达及纯化阳性克隆1%转种含2%葡萄糖，100μg/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培养液于30℃振荡培养约3h(OD600=0.6)，加入总滴度为109的辅助噬菌体M13KO7，并于37℃静置感染15min。离心收集菌体并重悬于3ml含50μg/ml卡那霉素(Kan)，100μg/mlAmp的LB中37℃培养液过夜。于10000r/min，4℃离心收集过夜培养上清，按每ml上清中加入150μlSA溶液(16%PEG6000，3.3mol/LNaCl)，4℃2h静置，于10000r/min，4℃沉淀噬菌体，沉淀重悬于100μl的LB培养液中。

1.8抗HBx单链噬菌体抗体的ELISA鉴定取10μl纯化的噬菌体单链抗体，按10倍稀释至10-6，以M13KO7为对照，和已包被的HBxAg的酶标板(由德国癌症中心提供)室温亲和30min，以鼠抗噬菌体抗体(mAb,Pharmacia,USA)为一抗，HRP-羊抗鼠IgG(华美生物工程公司)为二抗，检测抗HBx单链噬菌体抗体的亲和活性。

3讨论

1988年SmithGP建立噬菌体展示筛选技术以来［5］，该技术已被广泛应用于特异性抗体可变区的筛选，在噬菌体载体中构建单链或单区抗体，这种有活性表达的噬菌体抗体也已成为筛选特异性人源抗体的重要手段［6］。特异性抗体可变区在原核系统中的活性表达，在很大程度上推动了抗体工程的发展［7］，但是以强表达操纵子调控的高效原核表达导致了抗体蛋白大量以包涵体形式存在面临复性的难题。本研究尝试采用构建噬菌体单链抗体的方式探索以噬菌体为载体在原核系统中活性表达，制备单链基因工程抗体的可能。

我们的结果表明，设计的PCR引物可直接扩增HBx单链抗体的编码基因，在我们得到的5个不同克隆DNA序列分析结果中仅一例发生单基因突变，其余4例均为正常序列，这表明通过优化的PCR条件，可直接利用PCR获得可靠的目的基因用于表达。构建的噬菌体单链抗体是以抗体重链可变区-十肽小侧链柔性肽段-抗体轻链可变区以及3′端的六聚组氨酸尾组成插入噬菌体次要衣壳蛋白(基因Ⅲ产物，PⅢ)中融合表达。含有表达载体pCANTAB-HBx的大肠杆菌在辅助噬菌体M13KO7的感染下大量产生含有重组HBx单链抗体的噬菌体衣壳蛋白，并包装可溶性分泌于培养液上清，其含量可高达3×1013pfu/ml。同时利用简单的PEG/NaCl沉淀的方法即可制备量和纯度足以满足用于动物模型实验的活性单链抗体表达产物。此外，pCANTAB-HBx表达载体在适量的IPTG诱导下，激活的LacZ操纵子启动大量表达HBx单链抗体-PⅢ融合蛋白，并经噬菌体PⅢ信号肽引导可溶性分泌于培养液中，可利用融合于单链抗体3′端的六聚组氨酸抗体检测，以及Ni2+离子树脂吸附纯化［3］。由于目前的抗噬菌体单克隆抗体或抗血清针对的亲和靶位多为噬菌体主要衣壳蛋白(PⅧ)，因而我们在检测噬菌体抗体和检测单链融合抗体时分别应用了抗噬菌体和抗His-Tag抗体作为第一抗体。抗HBx噬菌体抗体的构建，表达为抗体可变区基因活性表达提供了一种高效，简单的方法。同时噬菌体抗体所特有的基因型和表型的一一对应特征，为抗体可变区全基因文库的筛选提供了有力的手段［8］。

作者简介：周铬，30岁，助理研究员，主要从事肿瘤导向研究；

秦慧莲，女，46岁，教授，主要从事肿瘤免疫研究

作者单位：周铬刘康达龚奕何进(上海医科大学附属中山医院实验研究中心，上海200032)

秦慧莲何曦(上海医科大学免疫学教研室，上海200032)

4参考文献

1LiJ,TangZY,LiuKDetal.Radioimmunoimagingofhumanhepatocellularcarcinomaxenograftswith131-I-HBxmonoclonalantibody.JExpClinCancerRes，1995；14(1):25

2ZhouG,LiuKD,TangZYetal.Reconstructionandexpressionofchimericanti-HBxantibodyinE.coli.JCancerResClinOncol,1997;123(6):325

3ZhouG,LiuKD,SunHCetal.Expressionandpurificationofsingle-chainanti-HBxantibodyinEscherichiacoli.JCancerResClinOncol,1997;123(12):609

4SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.Molecularcloning:Alaboratorymanual.2nded.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989：p14.5-14.52

5ParmleySF,SmithGP.Antibody-Selectablefilamentousfdphagevector:affinitypurificationoftargetgenes.Gene,1988；73(1):305

6WinterG，GriffithsAD.Makingantibodiesbyphagedisplaytechnology.AnnRevImmunol,1994；12(2):433