海马范文10篇

海马范文篇1

氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。

1材料与方法

1.1新生大鼠海马神经元的分离和培养

技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，D-Hank''''s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量0.25%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。

1.2大鼠海马神经元的鉴定

1.2.1烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色

取培养6d6孔培养板中的盖玻片进行神经元特异的NSE免疫组织化学染色。弃去培养液，4%多聚甲醛室温固定1h，加入0.3%H2O2甲醇去除内源性过氧化氢酶，0.1%TritonX-100破膜，10%绵羊血清封闭，加入一抗1∶200兔抗鼠NSE抗体，4℃湿盒过夜，0.01mmol·L-1PBS清洗，加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG，放入37℃温箱孵育60min;0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加SABC过氧化物酶复合物，37℃温箱中孵育60min，0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加DAB显色液作用3～10min，自来水冲洗后，常规脱水，透明封片。光镜下观察NSE表达阳性细胞。

1.2.2尼氏染色

6孔培养板的细胞培养7d时，取出盖玻片进行尼氏染色。弃去培养液，0.01mmol·L-1PBS清洗，4%多聚甲醛室温固定1h，0.01mmol·L-1PBS清洗3次，氯仿中1min，95%、70%乙醇各1min，蒸馏水清洗，置于1%甲苯胺蓝染液中染色20min，95%乙醇分化，在显微镜下观察控制，时间以尼氏体显示清晰为准，37℃干燥，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

1.3实验分组

在培养的第3天加入氟西汀（常州第四制药厂生产），根据药物浓度不同，将实验细胞分为5组，分别加入1、10、20、40μmol·L-1氟西汀;正常对照组加入等体积的培养基。

1.4海马细胞形态定量分析

倒置相差显微镜（德国Zeiss公司产品）下观察加药48h后的海马神经元形态，每组各孔随机选择20个视野（每个视野0.17mm2），记录每个视野内细胞长出突起的神经元数目，目镜测微尺随机测量15个神经元突起的长度和胞体的长径。

1.5统计学处理

应用SPSS12.0软件进行统计分析，各项检测结果以x-±s表示。多组比较及组间两两比较采用方差分析。

2结果

2.1海马神经元形态学观察

倒置相差显微镜下观察，培养1d，细胞绝大部分贴壁，细胞形态大小不一，以单突起的小细胞为主。培养6d，神经元胞体较大，突起进一步增多、延长，并形成稀疏的网络（图1）。培养12d，神经元胞体进一步增大，突起形成比较稠密的网络。培养24d，神经元胞体出现空泡，部分神经元死亡，胞体崩解，突触断裂。

2.2海马神经元鉴定

NSE免疫细胞化学染色:染色后光镜下观察第6天的神经细胞，胞浆和突起被染成棕黄色为NSE抗体表达阳性细胞，以3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度，经鉴定神经元的纯度为90%。见图2A。

2.3氟西汀对海马神经元形态学的影响

结果见表1和图3。不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是不同的，10μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、最长突起长度增长（P<0.05）;40μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目减少（P<0.05），最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）;1、20μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）。表1氟西汀对加药48h海马神经元形态学的影响（略）

3讨论

本实验严格控制胰酶的量和消化时间，采用了0.25%胰蛋白酶低浓度溶液、30min长时间消化的方法，尽可能减少分离过程中的化学损伤。为了避免操作过程中的机械损伤，分离时动作轻柔，规律换药，每72h半量换液1次，换液时速度快，以减少对神经元生长的影响。本实验采用了差速贴壁生长，去除了成纤维细胞，并采用B27无血清培养基，可以选择性地促使神经元生长，抑制非神经元的生长和繁殖［3］，从而可以纯化海马神经元。NSE是神经元分化成熟的特异性标志酶之一，它主要表达于神经元的胞体、轴突、树突部分［4］，通过NSE免疫细胞化学染色方法，可以鉴定体外培养的新生大鼠海马神经元及其纯度。本实验通过NSE免疫化学染色，发现大部分细胞胞浆和突起被染成棕黄色，计数阳性细胞百分率为90%。尼氏体是神经元的特征性结构之一，存在于神经元胞体和树突内，可被碱性染料染成深色的颗粒和斑块，它是细胞内的一种蛋白质合成装置，可作为观察神经细胞功能状态的灵敏指标。本实验观察到培养的海马神经元胞质内尼氏体数量较多，说明培养的海马神经细胞生长良好。NSE免疫细胞化学染色和尼氏染色结果提示，本实验能培养出纯度较高、生长良好的海马神经元。氟西汀不仅是广泛应用的抗抑郁药，而且可以用于治疗癫痫、偏头痛、认知障碍、焦虑障碍、儿童孤独症等诸多神经精神疾病。目前研究认为，氟西汀抗抑郁效应与它对海马的神经保护作用有关，这种作用可能是通过促进海马细胞增殖来抵抗神经元的萎缩和丢失来实现的。李鹂等［1］研究发现，氟西汀在显著改善抑郁大鼠抑郁行为的同时，增加了海马齿状回神经前体细胞的数目，其增殖也增强，推测促进海马神经元再生可能是氟西汀治疗抑郁症的机制之一。李云峰等［5］通过慢性应激建立小鼠抑郁模型，认为氟西汀促进海马齿状回神经元再生可能是抗抑郁剂共同作用机制之一，并且可能与提高海马BDNF水平密切相关。一些临床研究的结果也提示抗抑郁药具有神经保护作用。Santarelli等［6］

研究发现5-HT再摄取抑制剂能部分逆转认知功能障碍大鼠海马齿状回神经元增殖减少及树突萎缩，并能促进海马神经元的再生和存活。Yatte等［7］通过高分辨率的MRI和立体定位方法测定海马容量，发现持续性接受抗抑郁药物治疗与只在发作时接受治疗的患者相比，海马容量无显著性降低。

本研究首次以体外培养的新生SD大鼠海马神经元为模型，通过细胞形态定量分析，探讨氟西汀对海马神经元生长的影响。Chiou等［8］通过MTT方法，发现浓度在55μmol·L-1以下的氟西汀可明显促进海马神经干细胞存活，在20μmol·L-1时达到高峰。根据Chiou等［8］的研究结果，本实验选择了浓度分别为1、10、20、40μmol·L-1的氟西汀来干预海马神经元。结果发现不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是不同的，10μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、最长突起长度增长（P<0.05）;40μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目减少（P<0.05），最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）;1、20μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）。结果表明氟西汀对海马神经元生长的影响有浓度依赖性，浓度过低（1μmol·L-1）对海马神经元生长的作用不明显，适当浓度（10μmol·L-1）可以促进海马神经元的生长发育，浓度过高（40μmol·L-1）则抑制海马神经元的生长。本实验中氟西汀浓度为40μmol·L-1即出现对海马神经元的抑制作用，与Chiou等［8］研究结果不完全一致，表明氟西汀对海马神经元和神经干细胞的影响存在差异。氟西汀促海马神经元生长的机制尚不明了，有研究［9］表明，长期给予氟西汀后，大鼠海马神经元的脑源性神经营养因子（BDNF）mRNA表达明显高于对照组，而BDNF具有很强的刺激和促进神经细胞生长和分化，维持神经细胞存活和正常功能的作用，Dwivedi等［10］发现氟西汀不仅能够增加海马BDNFmRNA的表达，还可以逆转皮质酮导致的海马BDNFmRNA表达的降低。据此可以推测，氟西汀促海马BDNF表达可能是促海马神经元生长的机制之一。非营养因子家族，包括睫状神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子等，都能促进海马神经元的生长，氟西汀是否也可能通过上调这些因子的表达而促进海马神经元的生长有待研究。

本实验结果提示，氟西汀可以促进新生大鼠海马神经元的生长，这为氟西汀治疗与海马损害有关的神经精神疾病提供实验基础和理论依据。氟西汀促海马神经元生长的确切机制尚待进一步探讨。

【参考文献】

［1］李鹂，涂自良，杜士明，等.氟西汀对实验性抑郁症大鼠抑郁行为及海马神经元再生的影响［J］.医药导报，2006，25（4）:280-282.

［2］BrewerGJ.Isolationandcultureofadultrathippocampalneurons［J］.JNeurosciMethods，1997，71（2）:143-155.

［3］BrewerGJ，TorricelliJR，EvegeEK，etal.Optimizedsur-vivalofhippocampalneuronsinB27-supplementalneuron-basal，anewserum-freemediumcombination［J］.JNeurosciRes，1993，35（5）;567-576.

［4］SchmechelDE，BrightmanMW，MarangosPJ.Neuronsswitchfromnon-neuronalenolasetoneuron-specificenolaseduringdifferentiation［J］.BrainRes，1980，190（1）:195-214.

［5］李云峰，刘艳芹，张有志，等.抗抑郁剂对慢性应激小鼠海马神经元再生的影响［J］.中国药理学通报，2004，20（4）:385-388.

［6］SantarelliL，SaxeM，GrossC，etal.Requirementofhipp-ocampalneurogenesisforthebehavioraleffectsofantide-pressants［J］.Science，2003，301（5634）:805-809.

［7］YatteI，ShelineMD，MokhtarH，etal.Untreateddepressionandhippocampalvolumeloss［J］.AmJPsychiatry，2003，160（7）:1516-1518.

［8］ChiouSH，ChenSJ，PengCH，etal.Fluoxetineup-regu-latesexpressionofcellularFLICE-inhibitoryproteinandin-hibitsLPS-inducedapoptosisinhippocampus-derivedneuralstemcell［J］.BiochemBiophysResCommun，2006，343（2）:391-400.

海马范文篇2

【关键词】益智健脑颗粒；SAMP8小鼠；海马；双向凝胶电泳；质谱分析

益智健脑颗粒是董克礼教授多年临床实践治疗阿尔茨海默病(AD)的中药处方，临床上用于治疗AD之肾虚血瘀型,取得满意疗效〔1〕，动物实验研究能改善SAMP8小鼠的学习记忆能力〔2〕。本研究则在临床观察及前期动物实验的基础上，应用蛋白质组学技术鉴定益智健脑颗粒干预前后P8品系快速老化小鼠(SAMP8)海马组织的差异表达蛋白质，试图从蛋白质组水平探讨中药益智健脑颗粒治疗AD的作用机制，为临床用药提供理论依据。

1材料与方法

1.1动物及分组选用6月龄20只雄性SAMP8小鼠，随机分为治疗组和对照组,每组各10只，由天津中医学院附属第一医院动物部提供。

1.2药物、试剂与仪器益智健脑颗粒由淫羊藿、锁阳、川断、田七等组成，其水提浓缩液，相当于1ml含3g生药，由湖南德康制药有限公司加工制成。双向凝胶电泳试剂：2DQuantKit蛋白定量试剂盒，尿素，硫脲，NP40，TritonX100，二硫苏糖醇，碘乙酰胺，固相pH梯度干胶条（pH3～10，24cm），IPG缓冲液（pH3～10），两性电解质（pH3～10），覆盖液，双向凝胶电泳标准蛋白质，考马斯亮蓝G250,溴酚蓝均为瑞典AmershamBiosciences公司产品；琼脂糖，过硫酸氨,丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷，CHAPS和十二烷基硫酸钠，碳酸氢铵，三氟乙酸、乙腈和基质α氰基4羟基肉桂酸均为美国SigmaAldrich公司产品。胰蛋白酶，美国Promega公司产品。PDQuest双向凝胶图谱分析软件是美国BioRad公司产品，MascotMS/MS数据库查询软件是英国Matrixscience公司产品，IPGphor等电聚焦仪，Imagescanner扫描仪均为瑞典AmershamBiosciences公司产品，DataExplorer质谱分析软件，VoyagerDESTR4307MALDITOFMS质谱仪是美国AppliedBiosystem公司产品。

1.3方法

1.3.1动物喂养及标本收集治疗组和对照组小鼠喂养于层流室，温度18～22℃，湿度55%～58%，饮水及饲料高温蒸汽灭菌。小鼠灌胃剂量每天30g/kg计算。治疗组给予中药益智健脑颗粒浓缩液灌胃，1次/d。对照组给予相同体积的双蒸水灌胃，1次/d，持续8w。8w后，迅速断头处死治疗组和对照组小鼠，置于冰上，剥出脑组织，用冷生理盐水冲洗干净，除去血渍，取出所需的海马，置于EP管中，迅速置于液氮中保存。

1.3.2海马组织总蛋白的提取及浓度测定将海马组织从液氮中取出，立即放入预先称重的EP管中进行称重。然后根据50mg样品组织加入约400μl组织裂解液的比例加入组织裂解液（7mol/L尿素、2mol/L硫脲，2%NP40，1%TritonX100，0.5mmol/LEDTA，40mmol/LTris，4%CHAPS，100mmol/LDTT，5mmol/LPMSF）混合后，用研磨工具使海马组织充分研磨裂解，室温下静置孵育1h，间或涡旋混匀，然后1200r/min，4℃离心1h，吸取上清即为组织的总蛋白质。取少许（5μl）上清液（组织总蛋白质）测定蛋白质浓度。采用AmershamBiosciences公司专门针对蛋白质组学研究的蛋白质抽提设计的2DQuantKit定量试剂盒测定蛋白质浓度。

1.3.3双向凝胶电泳每块胶的上样量1500μg。将胶条槽放置于平台上，将样品加入胶条槽中，取出IPG干胶条（pH3～10）置入含蛋白质样品的胶条槽中，再将胶条槽平行放置于IPGphor等电聚焦仪上进行第一向电泳。等电聚焦电泳结束后，将胶条先后放在平衡缓冲A液(平衡缓冲贮液10ml＋DTT100mg)和平衡缓冲B液(平衡缓冲贮液10ml＋碘乙酰胺250mg)中各平衡15min。然后将胶条转移至12.5%的PAGE分离胶上端，进行第二向电泳。

1.3.4图像染色与扫描将凝胶从玻璃板上剥离下来，双蒸水清洗干净后用考马斯亮蓝G250的蓝银染色方法进行蓝银显色，通过扫描仪及扫描软件进行扫描获取图像，使用PDQuest图像分析软件进行凝胶图像分析。

1.3.5质谱分析将蛋白质点从凝胶上切取下来，脱色、酶解后对样品萃取、点样。用MALDITOFMS质谱仪中进行分析，获得肽质量指纹图谱（PMF），再利用NCBI数据库进行检索。

2结果

得到背景清晰、分辨率高、重复性好的2DE图谱各3张。每张2DE图谱约有900个蛋白质点，大多数蛋白质点在位置和丰度上是一致的，主要分布在pH4～8的范围内。选择差异在两倍以上的16个蛋白质斑点作为差异表达的蛋白质点进行质谱分析，最后得到鉴定的差异表达蛋白质点为13个(各个蛋白具体在凝胶上的分布见图1)。这些蛋白质的功能分别涉及到细胞骨架蛋白、代谢相关酶类、信号传导和激素等多个方面。在治疗组中表达上调的有8个，分别为1、2、4、5、9、10、11、13号蛋白，表达下调的有5个，分别为3、6、7、8、12号蛋白。每个蛋白的具体情况见表1。表1差异表达蛋白质信息

3讨论

AD发病机制现存在多种假说：能量代谢障碍、激素缺乏、细胞凋亡、淀粉样蛋白神经毒性作用、炎症、自由基损伤等。本实验鉴定的13种蛋白质点，分别涉及到能量代谢、细胞凋亡、细胞骨架、激素等多个方面。肽酰脯氨酰顺反式异构酶A(Pin1)属于微小菌素蛋白的一种酶，Pin1蛋白是一种相对大分子量(18kD)的肽酰脯氨酰异构酶。Pin1与磷酸化的微管相关蛋白(tau)蛋白结合，而磷酸化的tau蛋白聚集形成神经元纤维缠结，这样就使Pin1过多结合于纤维结上，使可利用的游离Pin1减少或缺乏，从而诱导神经元凋亡，这可能是AD发病机制之一〔3～5〕。有研究表明，外源性Pin1的加入可以恢复tau蛋白使微管聚集的生物学特征，即加入的Pin1与磷酸化的tau蛋白结合，使其异构化，成为磷蛋白磷酸酶2A型(ProteinPhosphatase2A,PP2A)的最适底物，PP2A使tau蛋白去磷酸化，从而恢复tau蛋白使微管蛋白聚集的生物学功能，减少神经纤维缠结的形成〔6〕。磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解的关键酶，PGK基因发生突变会导致智力减退〔7〕，这个酶是一个有重要价值的、具有潜力的药物设计的靶标〔8〕。

近年研究发现，雌激素可通过多种途径和环节影响AD的发生和发展〔9，10〕。流行病学调查表明，绝经后妇女AD的发病率较同龄男性高1.5～3.1倍，原因与绝经后妇女丧失了雌激素的保护作用有关〔11〕。接受雌激素治疗的患者脑血流量增加,尤其是在海马、海马沟回、颞叶等与认知功能相关的脑区〔12〕。大脑的海马区与记忆和学习的关系密切，在此区域发现了大量的雌激素受体(ER)。雌激素α受体主要在海马锥体层神经元中表达，雌激素α受体阳性神经元主要分布在CA3和CA4亚区，而在CA1区较少。AD病理学上的一个重要特征为CA1区较CA3区更易发生神经退变，雌激素α受体分布与AD病理变化部位的高度重合提示雌激素可能参与了AD的发病〔13〕。

中药益智健脑颗粒是由淫羊藿、锁阳、川断、刺五加、柏仁、水蛭、田七等药物组成的复方，适用于肾虚血瘀型的老年痴呆。本实验发现，中药益智健脑颗粒通过改善能量代谢、抑制细胞凋亡、构成细胞骨架、增加激素等多途径、多靶点治疗AD。

【参考文献】

1董克礼,宋治.益智健脑颗粒治疗早老性痴呆64例临床观察〔J〕.湖南中医杂志，1999；15(4):56.

2杨聘,董克礼,曾望远.益智健脑颗粒对快速老化鼠SAMP8学习记忆的改善作用〔J〕.中国行为医学科学,2005;14(7):6012.

3LuPJ，WulfG，ZhouXZ,etal.TheprolylisomerasePinlrestoresthefunctionofAlzheimer′sassociatedphosphorylatedtauprotein〔J〕.Nature,1999;399(6738)：7848.

4GoedertM.Alzheimer′sdisease.Pinningdownphosphorylatedtau〔J〕.Nature，1999;399(6738):73943.

5VincentI，JichaG，RosadoM,etal.Aberrantexpressionofmitoticcdc2/cyclinB1kinaseindegeneratingneuronsofAlzheimer′sdiseasebrain〔J〕.Neuroscience，1997;17(10)：358898.

6ZhouXZ，KopsO，WernerA,etal.Pin1dependentprolylisomerizationregulatesdephosphorylationofCdc25Candtauproteins〔J〕.MolCell，2000;6(4)：87383.

7ColetteValentin，HenrikBirgens，CraescuCT.Aphosphoglyceratekinasemutant(PGKHerlev,D285V)inaDanishpatientwithisolatechronichemlyticanemia:mechanismofmutationandstructurefunctionrelationships〔J〕.HumanMutation，1998;12（4）:2807.

partmentationofcarbohydratemetabolismintrypa

nosemes〔J〕.AnnuRevMicrobiol,1987;41:12751.

9吕海燕,贾建平.雌激素治疗阿尔茨海默病的争议〔J〕.中国临床康复，2005;9(13)：1257.

10杨华，武成斌，屈秋民.雌激素与阿尔茨海默病〔J〕.中国临床康复,2004;8(1)：14850.

11BieberEJ,CohenDP.Estrogensandhormonereplacementtherapy:istherearoleinthepreservationofcognitivefunction〔J〕.IntJFertilWomensMed，2001;46(4):2069.

海马范文篇3

【关键词】铅；硒；海马；神经元；神经突起

铅具有显著的神经发育毒性。毒理学实验和人群流行病学调查表明，铅能对神经系统造成不可逆性损害，严重损坏海马神经元，影响学习、记忆及行为发育〔1，2〕。硒有防止铅吸收和加速其排泄的作用，因此，硒有可能成为有效防治铅神经毒性的重要资源〔3〕。为了解硒拮抗铅神经毒性的效果和研究其拮抗作用机制，同时也为更多有效地利用硒，本试验对体外原代培养的Wistar乳鼠海马神经元进行低剂量PbCl2和Na2SeO3染毒，观察低水平铅、硒单独和联合作用对神经细胞生长和存活的影响。

1材料与方法

11材料

111试剂解剖液、种植培养液、无血清培养液［由98%Neurobasal培养基和2%B27(美国Gibco公司)无血清培养基添加剂和1%的青霉素、链霉素和005mol/L的谷氨酰胺(美国Sigma公司)组成］；胰酶、DNaseⅠ、左旋多聚赖氨酸和台盼兰(美国Sigma公司)；PbCl2(上海试四赫维化工有限公司)；Na2SeO3(天津化学试剂研究所)。神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体和神经丝蛋白(NF)抗体(北京中山生物技术有限公司)。

112仪器CO2细胞培养箱(美国ShelLab公司)；全自动图像分析系统(德国KONTRON公司)；图像摄录输入仪(日本JVC公司)；倒置显微镜(德国ZEISS公司)。

113动物出生24h内Wistar大鼠(中山大学北校区动物中心)。

12方法

121海马神经细胞的分散、移植和培养参考文献〔4〕，将乳鼠全身消毒后分层剪开头皮和颅骨，暴露两侧脑半球，分开颞叶皮层，暴露并取出海马回，置解剖液中；清洗后剪碎成糊状，0125%胰酶消化20min，终止消化后离心、过筛、CO2培养箱内培养。第2d更换无血清培养液，以后每隔2d换液1次，每次更换一半培养液。培养第2，3，4，5，6和7d在倒置显微镜下观察细胞生长情况。

122分组及染毒设对照组、Pb组、Se组、Pb+Se组和先Pb后Se组。对照组加入30μl的磷酸盐缓冲液，Pb组加入30μlNa2SeO3，Pb+Se组同时加入PbCl2和Na2SeO3各30μl，先Pb后Se组于培养第2d换液时加入30μl的PbCl2，次日半量换液并加入30μl的Na2SeO3。使PbCl2、Na2SeO3的终浓度分别为1×10-5mol/L和2×10-6mol/L。以后换液时补入相应量的PbCl2或Na2SeO3，维持终浓度不变。

123神经元存活率的测定每次到培养的时间终点，收集细胞，洗涤定容后取10μl细胞悬液台盼兰拒染法进行镜下活细胞计数，获得各个剂量组不同时间终点的活细胞总数，再分析与同一观察时间的对照组的活细胞总数，比较计算各组细胞的相对存活率。

124神经元突起的测定倒置显微镜下(200×)，随机选择3个视野，利用图像自动分析仪测量形态可辨的所有神经元突起的长度。

2结果

21海马神经元形态观察对照组和单独硒作用组的海马神经元镜下呈圆形，体积小，透亮，散在分布；培养2h后开始贴壁，6h后绝大部分细胞已贴壁，光晕明显；12h细胞几乎全部贴壁，且长出短小的突起；2d后细胞有明显增长的突起，胞体饱满多数呈梭形、锥形，胞浆丰富，核大，核仁隐约可见，背景中可见极少数扁平状多边形的神经胶质细胞铺垫；5～6d细胞相互间搭连成片，胞体间突起连接成网状逐渐明显；7d神经元数目不等地聚集成团，突起联结成网。与对照组比较，单独硒作用组的神经元胞体更丰满，神经元突起更长、更粗壮。铅单独作用组(10-5mol/L)的神经元生长改变情况如下：(1)贴壁减少：24h后，培养基中悬浮细胞数目较对照组多，贴壁细胞数减少，致使细胞在培养皿底部分布不均匀；(2)生长迟缓：第3d与对照组比较，散在分布的小体积圆形透亮细胞仍然较多，形态和大小与细胞刚种植时的情形无明显差别；(3)出芽延迟：对照组12～24h即可见短小突起，铅细胞种植后第2d才开始看见细胞变成梭形，伸出短小突起；(4)碎片增多：倒置显微镜下的视野中悬浮细胞和死亡细胞的碎片较多，培养后第7d，培养皿中的神经元已极其稀疏；(5)成团提前：正常神经元在本培养条件下第7d可见明显的成团现象，铅组于第4d即可见神经元细胞5～10个聚齐成团，第5d可见成团细胞中间神经元边界模糊，核仁消失，部分出现裂解，第7d成团神经元消失，皿中细胞数目显著减少。铅硒同时作用组神经元生长的改变情况与铅作用组相似，也出现了贴壁减少、生长迟缓、碎片增多和成团提前的改变，但是二者不完全相同，铅硒同时作用组神经元出芽晚于对照组但较铅组早，培养第6和第7d，贴壁神经元数目明显较铅组多。先加铅后加硒作用组早期改变与铅组相同，但从培养第4d开始，与铅组相比，贴壁神经元数目增多，细胞碎片减少，突起较多且较为粗壮。

22海马神经元存活率分析(表1)表1可见，10-5mol/L铅引起神经元存活率明显下降；单独硒(2×10-6mol/L)对海马神经元存活率的影响不明显；铅硒同时孵育组，存活率最低，提示使用的硒作用剂量可能偏高。

表1Pb、Se对海马神经元存活率的影响（略）

23海马神经元突起长度分析(表2)表2可见，10-5mol/L铅明显抑制了原代培养的海马神经元突起生长(P005)，单独硒(2×10-6mol/L)作用有明显促进海马神经元突起生长的作用，尤其在神经元突起生长早期(P005)；铅和硒共同孵育时，培养早期硒能拮抗铅对神经元突起延伸的抑制(P005)，但随着培养时间延长，这种拮抗作用变得不明显。

表2Pb、Se对海马神经元突起长度的影响（略）

注：与对照组比较，aP005；与Pb组比较，bP005；与Se组比较，cP005

3讨论

低剂量的铅一方面可以引起包括神经细胞在内的多种细胞发生凋亡〔4，5〕，另一方面可以通过多种途径引发神经元死亡〔6，7〕。因此，本研究所观察到的铅抑制体外培养的神经元的存活，应该是铅诱导神经元凋亡和诱发神经元坏死共同作用的结果。本次实验发现，硒对体外培养的海马神经元突起的生长有很明显的促进作用，但作用机制不清楚，硒是否在神经元生长发育过程中参与了对神经细胞粘附因子(NCAM)表达调控需进一步研究。本实验中未观察到硒对体外培养的海马神经元的存活有明显的影响。铅硒共育组较铅组在神经元突起长度上存在差异，尤其在生长早期，提示硒对铅抑制神经元突起生长具有一定的拮抗作用，至于这种拮抗作用随培养时间延长而逐渐减弱至不显著，认为可能与铅的毒作用剂量过高有关，从神经元存活率的结果也能反映这一点，由于高剂量的铅导致对神经元生长的累积毒效应已经超过了硒的拮抗能力。提示应进一步降低铅的毒作用剂量再进行观察研究。

参考文献

〔1〕StewartWF,StewatBS,SimonD,etal.Neurobehavioralfunctionandtibialandchelatableleadlevelsin543formerorganoleadworkers［J］.Neurology,1999,52(8):1610-1617.

〔2〕胡前胜，董胜璋，任铁玲，等.儿童齿铅与智商关系流行病学研究［J］.环境与健康杂志，1999，16(1)：16.

〔3〕NehruB,DuaR.Theeffectofdietaryseleniumonleadneurotoxicity［J］.JEnvironpatholtoxicoloncol,1997,16(1):47-50.

〔4〕DelaFuenteH,PortalesPerezD,BarandaL,etal.Effectsofarsenic,cadmiumandleadontheinductionofapoptosisofnormalhumanmononuclearcells［J］.ClinExpImmunol,2002,129(1):69-77.

〔5〕HeL,PobenzAT,MedranoCJ,etal.Leadandcalciumproducerodphotoreceptorcellapoptosisbyopeningthemitochondrialpermeabilitytransitionpore［J］.JBioChem,2000,275:12175-12184.

海马范文篇4

氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。

1材料与方法

1.1新生大鼠海马神经元的分离和培养

技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，D-Hank''''s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量0.25%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。

1.2大鼠海马神经元的鉴定

1.2.1烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色

取培养6d6孔培养板中的盖玻片进行神经元特异的NSE免疫组织化学染色。弃去培养液，4%多聚甲醛室温固定1h，加入0.3%H2O2甲醇去除内源性过氧化氢酶，0.1%TritonX-100破膜，10%绵羊血清封闭，加入一抗1∶200兔抗鼠NSE抗体，4℃湿盒过夜，0.01mmol·L-1PBS清洗，加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG，放入37℃温箱孵育60min;0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加SABC过氧化物酶复合物，37℃温箱中孵育60min，0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加DAB显色液作用3～10min，自来水冲洗后，常规脱水，透明封片。光镜下观察NSE表达阳性细胞。

1.2.2尼氏染色

6孔培养板的细胞培养7d时，取出盖玻片进行尼氏染色。弃去培养液，0.01mmol·L-1PBS清洗，4%多聚甲醛室温固定1h，0.01mmol·L-1PBS清洗3次，氯仿中1min，95%、70%乙醇各1min，蒸馏水清洗，置于1%甲苯胺蓝染液中染色20min，95%乙醇分化，在显微镜下观察控制，时间以尼氏体显示清晰为准，37℃干燥，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

1.3实验分组

在培养的第3天加入氟西汀（常州第四制药厂生产），根据药物浓度不同，将实验细胞分为5组，分别加入1、10、20、40μmol·L-1氟西汀;正常对照组加入等体积的培养基。

1.4海马细胞形态定量分析

倒置相差显微镜（德国Zeiss公司产品）下观察加药48h后的海马神经元形态，每组各孔随机选择20个视野（每个视野0.17mm2），记录每个视野内细胞长出突起的神经元数目，目镜测微尺随机测量15个神经元突起的长度和胞体的长径。

1.5统计学处理

应用SPSS12.0软件进行统计分析，各项检测结果以x-±s表示。多组比较及组间两两比较采用方差分析。

2结果

2.1海马神经元形态学观察

倒置相差显微镜下观察，培养1d，细胞绝大部分贴壁，细胞形态大小不一，以单突起的小细胞为主。培养6d，神经元胞体较大，突起进一步增多、延长，并形成稀疏的网络（图1）。培养12d，神经元胞体进一步增大，突起形成比较稠密的网络。培养24d，神经元胞体出现空泡，部分神经元死亡，胞体崩解，突触断裂。

2.2海马神经元鉴定

NSE免疫细胞化学染色:染色后光镜下观察第6天的神经细胞，胞浆和突起被染成棕黄色为NSE抗体表达阳性细胞，以3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度，经鉴定神经元的纯度为90%。见图2A。

2.3氟西汀对海马神经元形态学的影响

结果见表1和图3。不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是不同的，10μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、最长突起长度增长（P<0.05）;40μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目减少（P<0.05），最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）;1、20μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）。表1氟西汀对加药48h海马神经元形态学的影响（略）

3讨论

本实验严格控制胰酶的量和消化时间，采用了0.25%胰蛋白酶低浓度溶液、30min长时间消化的方法，尽可能减少分离过程中的化学损伤。为了避免操作过程中的机械损伤，分离时动作轻柔，规律换药，每72h半量换液1次，换液时速度快，以减少对神经元生长的影响。本实验采用了差速贴壁生长，去除了成纤维细胞，并采用B27无血清培养基，可以选择性地促使神经元生长，抑制非神经元的生长和繁殖［3］，从而可以纯化海马神经元。NSE是神经元分化成熟的特异性标志酶之一，它主要表达于神经元的胞体、轴突、树突部分［4］，通过NSE免疫细胞化学染色方法，可以鉴定体外培养的新生大鼠海马神经元及其纯度。本实验通过NSE免疫化学染色，发现大部分细胞胞浆和突起被染成棕黄色，计数阳性细胞百分率为90%。尼氏体是神经元的特征性结构之一，存在于神经元胞体和树突内，可被碱性染料染成深色的颗粒和斑块，它是细胞内的一种蛋白质合成装置，可作为观察神经细胞功能状态的灵敏指标。本实验观察到培养的海马神经元胞质内尼氏体数量较多，说明培养的海马神经细胞生长良好。NSE免疫细胞化学染色和尼氏染色结果提示，本实验能培养出纯度较高、生长良好的海马神经元。氟西汀不仅是广泛应用的抗抑郁药，而且可以用于治疗癫痫、偏头痛、认知障碍、焦虑障碍、儿童孤独症等诸多神经精神疾病。目前研究认为，氟西汀抗抑郁效应与它对海马的神经保护作用有关，这种作用可能是通过促进海马细胞增殖来抵抗神经元的萎缩和丢失来实现的。李鹂等［1］研究发现，氟西汀在显著改善抑郁大鼠抑郁行为的同时，增加了海马齿状回神经前体细胞的数目，其增殖也增强，推测促进海马神经元再生可能是氟西汀治疗抑郁症的机制之一。李云峰等［5］通过慢性应激建立小鼠抑郁模型，认为氟西汀促进海马齿状回神经元再生可能是抗抑郁剂共同作用机制之一，并且可能与提高海马BDNF水平密切相关。一些临床研究的结果也提示抗抑郁药具有神经保护作用。Santarelli等［6］

研究发现5-HT再摄取抑制剂能部分逆转认知功能障碍大鼠海马齿状回神经元增殖减少及树突萎缩，并能促进海马神经元的再生和存活。Yatte等［7］通过高分辨率的MRI和立体定位方法测定海马容量，发现持续性接受抗抑郁药物治疗与只在发作时接受治疗的患者相比，海马容量无显著性降低。

本研究首次以体外培养的新生SD大鼠海马神经元为模型，通过细胞形态定量分析，探讨氟西汀对海马神经元生长的影响。Chiou等［8］通过MTT方法，发现浓度在55μmol·L-1以下的氟西汀可明显促进海马神经干细胞存活，在20μmol·L-1时达到高峰。根据Chiou等［8］的研究结果，本实验选择了浓度分别为1、10、20、40μmol·L-1的氟西汀来干预海马神经元。结果发现不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是不同的，10μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、最长突起长度增长（P<0.05）;40μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目减少（P<0.05），最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）;1、20μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）。结果表明氟西汀对海马神经元生长的影响有浓度依赖性，浓度过低（1μmol·L-1）对海马神经元生长的作用不明显，适当浓度（10μmol·L-1）可以促进海马神经元的生长发育，浓度过高（40μmol·L-1）则抑制海马神经元的生长。本实验中氟西汀浓度为40μmol·L-1即出现对海马神经元的抑制作用，与Chiou等［8］研究结果不完全一致，表明氟西汀对海马神经元和神经干细胞的影响存在差异。氟西汀促海马神经元生长的机制尚不明了，有研究［9］表明，长期给予氟西汀后，大鼠海马神经元的脑源性神经营养因子（BDNF）mRNA表达明显高于对照组，而BDNF具有很强的刺激和促进神经细胞生长和分化，维持神经细胞存活和正常功能的作用，Dwivedi等［10］发现氟西汀不仅能够增加海马BDNFmRNA的表达，还可以逆转皮质酮导致的海马BDNFmRNA表达的降低。据此可以推测，氟西汀促海马BDNF表达可能是促海马神经元生长的机制之一。非营养因子家族，包括睫状神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子等，都能促进海马神经元的生长，氟西汀是否也可能通过上调这些因子的表达而促进海马神经元的生长有待研究。

本实验结果提示，氟西汀可以促进新生大鼠海马神经元的生长，这为氟西汀治疗与海马损害有关的神经精神疾病提供实验基础和理论依据。氟西汀促海马神经元生长的确切机制尚待进一步探讨。

【参考文献】

［1］李鹂，涂自良，杜士明，等.氟西汀对实验性抑郁症大鼠抑郁行为及海马神经元再生的影响［J］.医药导报，2006，25（4）:280-282.

［2］BrewerGJ.Isolationandcultureofadultrathippocampalneurons［J］.JNeurosciMethods，1997，71（2）:143-155.

［3］BrewerGJ，TorricelliJR，EvegeEK，etal.Optimizedsur-vivalofhippocampalneuronsinB27-supplementalneuron-basal，anewserum-freemediumcombination［J］.JNeurosciRes，1993，35（5）;567-576.

［4］SchmechelDE，BrightmanMW，MarangosPJ.Neuronsswitchfromnon-neuronalenolasetoneuron-specificenolaseduringdifferentiation［J］.BrainRes，1980，190（1）:195-214.

［5］李云峰，刘艳芹，张有志，等.抗抑郁剂对慢性应激小鼠海马神经元再生的影响［J］.中国药理学通报，2004，20（4）:385-388.

［6］SantarelliL，SaxeM，GrossC，etal.Requirementofhipp-ocampalneurogenesisforthebehavioraleffectsofantide-pressants［J］.Science，2003，301（5634）:805-809.

［7］YatteI，ShelineMD，MokhtarH，etal.Untreateddepressionandhippocampalvolumeloss［J］.AmJPsychiatry，2003，160（7）:1516-1518.

［8］ChiouSH，ChenSJ，PengCH，etal.Fluoxetineup-regu-latesexpressionofcellularFLICE-inhibitoryproteinandin-hibitsLPS-inducedapoptosisinhippocampus-derivedneuralstemcell［J］.BiochemBiophysResCommun，2006，343（2）:391-400.

海马范文篇5

关键词：人像摄影；海马体照相馆；市场细分；情感营销

一、海马体照相馆的发展概况

近年来，随着国民经济的进一步发展，我国人像摄影行业不断发展壮大。2016年，全行业总收入3168．7亿元，同比增长17．1％。行业经营单位41．6万家，同比增长3％。从业人员602万人，同比增长0．9％，新增就业5．2万人。人像摄影业营业额占全年国内生产总值74．4万亿元的0．4％，新增就业人数占全国城镇新增就业人口1314万人的0．4％＇据不完全估计，2017年人像摄影业行业收入增加576．7亿元，达3745．4亿元，同比增长18．2％；行业经营单位43．6万家，同比增长5％；从业人员609．22万人，同比增长1．2％，新增就业7．22万人＇由此可见，人像摄影行业已经成为促进我国经济增长、提升就业率、提高人民物质生活和精神生活品质的重要行业。在人像摄影行业为国家“稳增长、惠民生、保就业、促和谐”大发展的同时，行业内的一匹黑马以其强劲的发展势头引人关注：2011年11月10日，海马体照相馆母公司——杭州缦图摄影有限公司成立，主营摄影业务，致力于为顾客提供极致的拍摄体验与优质的摄影服务。目前，旗下已有包括“HIMO海马体照相馆”“HIMOKIDS海马体照相馆儿童”“缦图摄影”“WINDC－CI”“HIMOBUSINESS”、HIMOMASTER、缦图云端、缦图莱思学院8大品牌。自创业以来，海马体照相馆覆盖了52座城市，落地门店157家，坐拥350多万顾客。海马体照相馆如何能在较短时间内在业界竞争者中脱颖而出，并迅速扩张获得成功，其经验值得业界分析思考并借鉴。

二、海马体照相馆的成功秘诀剖析

（一）抓住传统影楼进入疲态期的契机，精准细分市场。在市场竞争愈加激烈的环境下，沿袭台湾模式的传统影楼和当前部分所谓改进版的新型影楼，行业模式无大的创新，拍摄技术水平低、服务同质化，市场竞争又趋于白热化，导致恶性竞争升级，低水平价格竞争加剧，价格战成为唯一的竞争工具，各服务环节二次消费成为潜规则，行业诚信度和口碑欠佳。影楼经营开始陷入“低价抢客—流水线式拍照—客户投诉率高—口碑差—增加流量成本低价抢客—企业净利润降低—生存困难”的恶性经营模式，不少影楼都面临被淘汰的危机。影楼进入疲态期为新型人像摄影模式提供了契机，海马体照相馆紧抓契机，深入调查市场，对人像摄影市场进行精准细分。（二）锁定目标市场进行“精致证件照”的精准定位。海马体照相馆对年轻消费群体调查发现，像证件照、结婚登记照这些意义非凡的“小照片”，传统影楼低品质的流水线式制作，让很多消费者得不到满意的成品。而像职场形象照这样的“大照片”，影楼却又把简单的事情复杂化了，明明每次只需要两张照片，但按照传统影楼的规矩，消费者必须专门到影楼拍许多底片，不仅花了一大笔钱，费时费力不说，效果也不好。基于市场调查结果，海马体照相馆将目标市场精准锁定“精致证件照”的细分市场，主营证件照、形象照、文艺照、全家福等。从证件照出发，成功孵化出了“全年主打”和“限时记忆”两条产品线。全年主打包括证件照、签证照、结婚登记证、职业形象照等多种形象展示型的照片；限时记忆则包括圣诞照、新年照等系列。无论是全年主打还是限时记忆，海马体照相馆要做的都是“成为你记忆中转站，留下片刻的你”。为此，海马体照相馆采用“把原来的小照片做重，把原来的大照片做轻”的方式，将小照片通过化妆、更衣、拍摄、后期处理等各种各样服务的升级，使品质更精致、服务更到位、照片更具观赏性和保存价值。大照片则在海马体门店通过比较简洁的方式，用两三个小时拍摄完成，大大降低了原来影楼的高门槛，同时还提高了拍摄的品质。由此，海马体照相馆成功抓住了传统影楼的疲态期，从证件照细分市场出发，将细分市场做精做专，成为行业翘楚。（三）通过成功质量管理有效提升顾客满意度。现代管理学之父彼得？德鲁克曾说过：“企业目标唯一有效的定义是创造顾客。”在市场竞争激烈的今天，企业间的竞争本质上是对顾客资源的争夺。而质量是开发顾客、维护顾客、提高顾客忠诚度的最有效保证。海马体照相馆能在短期内获得行业标杆的地位与其严格的质量管理密不可分。海马体照相馆从优化服务流程设计开始，环环相扣，层层把关，成功地完成质量管理。其服务流程是：微信客户端预约—微信客户端买单—约定时间到店—现场化妆造型—专业拍摄样片—本人选片—上传公司云端专业修图师精修—根据顾客意见门店第二轮精修—顾客最终满意成片—顾客在微信端下载成片并评价服务—引导顾客分享到社交平台。从流程设计来看：一是微信平台预约大大方便了顾客，使其可以更合理地安排时间，不用把大量时间花在等待上，大大降低了顾客的时间成本，提升了顾客的感知价值。二是在化妆造型环节，向顾客提供知名品牌的化妆品、充足的卸妆湿巾及各种适宜款式的服装，将细致的基础服务做到最优化，让顾客体验到更高的服务价值，进一步提升顾客的整体感知价值。三是照片必须经过两轮专业精修并最终以顾客满意为标准，方能成片的品质标准，有效地保证了照片质量和顾客满意度。四是微信下载成片一改传统店铺用U盘拷底片这一极不方便又容易丢失的做法，顾客随时可以下载成片，方便快捷且永久保存，大大提升了顾客感知产品的可靠性，进一步提升了顾客的感知价值。五是提供美甲、咖啡等服务，使得顾客在等待过程中降低了精神成本、体力成本，同时提高了感知服务的多样性，再次提升了顾客的感知价值。六是在整个服务流程中，从前期预约到化妆拍摄、修片和评价体系，每一个流程都有不同的专业人员负责，员工权责明确，各司其职，以高标准的专业化素养保证每一环节达到预期效果。不仅让顾客360度体验了“最美证件照”整个过程，也展现了企业的服务态度、完善了员工服务情况的监督，获得了顾客的好评。据调查，92．6％的顾客认为照片质量是“最美证件照”主题工作室的关键因素。增值类服务的多样性、预约的便捷程度、工作人员服务态度，都是影响顾客满意度的因素，占的比重依次为53．4％、48．2％、47．6％。从中可以发现对于顾客而言，“最美证件照”摄影工作室应该具备的要素除了拥有较高的摄影水准外，还需要具备预约便捷、服务优质等特质。与传统照相馆相比，海马体照相馆顾客满意度相对较高，达83．6％，且有65％的顾客在体验过后愿意将海马体照相馆推荐给他人＇（四）加盟形式加快扩张，短期内提高市场占有率。海马体照相馆主营证件照、签证照、全家福、宠物照、轻婚纱、结婚照等。这几种产品的拍摄手法、灯光、以及pose都可以标准化。与婚纱摄影相比，对摄影师的技术要求相对简单，可通过快速的培训进行复制，并保证各个店铺照片效果统一。符合海马体照相馆加盟条件，投资20万？50万元后即可加盟。海马体照相馆总部会提供包括互联网支持、全方位的培训、管理，以总部代运营的模式使双方成为利益共同体。营销与产品创新由总部专业团队负责整体规划，并提供专业选址团队帮助进驻当地好的商场，还有精准的财务数据分析支持。自海马体照相馆哈尔滨店开业起，便开启了全国连锁经营模式。在全国不断扩张发展，遍布一二线城市，并不断提升技术与服务。加盟形式不仅整合优化了资源，建立了一套快速复制拓展盈利的模式，也加快了海马体照相馆在国内人像摄影市场的扩张步伐，为海马体成为全国知名摄影品牌起了关键作用。

三、对“互联网＋”环境下企业营销创新的启示

（一）以信息化技术和“互联网＋”模式助推成功。在行业竞争日趋激烈的情况下，证件照这一细分市场并不是海马体照相馆第一个关注的。胶片时代，证件照当时在店里拍摄加冲洗，一寸照片是10元一版，加急20元。拍摄设备就是简单的一个卡片机，加一组红蓝白可切换的背景布，没有化妆师，十分简陋。但是证件照却是成本低、利润高的一个项目，大概一天能拍个两三单。当时就有很多小店开始做精致的证件照，在拍摄证件照之前化妆，做灯光，提供精修，三种底色收100元左右，生意还是不错的。其中知名度最高的当属“神奇照相馆”，该照相馆本名叫群林摄影社，位于上海市广灵一路。大学生拍摄前先化妆，照过之后还会进行修片处理。因拍摄效果好，被口口相传“拍得有整容效果”，成了“神奇照相馆”。鼎盛的时候一天要拍50套照片。但随着经营成本不断攀升，店主陈仲群将一套精修照片从25元涨到了50元，最后涨到了80元，依然无法跟上房租上涨。加上竞争加剧，很多店都是靠相机和PS揽生意，效果虽然不好，但是价格上比其有优势，客户流失在所难免。照相馆终于在苦心经营了18年后于2011年关闭，这一消息传到微博上并经媒体报道后，400多人在最后一天赶来拍照留念。面对赶来的热情顾客，店主陈仲群最想问的是“你们之前去哪儿了？”［4］海马体照相馆没有重蹈覆辙的关键是顺应信息化时代的发展，采用了“互联网＋”经营模式。信息化互联网技术方兴未艾，传统行业要么创新变革，要么被颠覆。运用saas服务、图片传输、大数据、云计算、移动互联网等进一步提升了人像摄影业的规模与水平，为人像摄影提供了创新动力和技术支撑。为了遵循轻、快、简的原则，海马体照相馆融入互联网思维，在线上平台开通在线预约功能，将流程尽可能地变得简便和快捷。此外，为确保照片的质量，海马体照相馆秉持专业严谨的态度，将选定的照片传至总部“云图像处理中心”，由海马体总部专业的团队进行精修，让其成为顾客满意的作品。可见，海马体照相馆不单将互联网当成获客渠道，还创新运用移动互联网、云计算、大数据、云储存、移动支付等信息技术手段，髙效地整合线上线下资源，用创新的“互联网＋”经营模式使得互联网成为人像摄影业提质增效的新引擎，成为行业标杆。（二）以细致入微的情感营销俘获新生代顾客的心。情感营销是从顾客的情感需要出发，通过情感品牌、情感产品、情感服务、情感广告、情感环境等手段唤起并满足顾客的情感需求，实现企业的营销目标。在物质生活水平越来越高的今天，消费已经进入了情感消费时代，顾客购买商品时越来越侧重一种感情上的满足、心理上的认同。成功的情感营销可以通过诱导顾客情感上产生共鸣，让有情的营销赢得无情的商战。调查显示，海马体照相馆主要消费群体年龄以18？28岁为主，占54．5％；其次是29？39岁和小于17岁，占27．5％和18％＇从数据分布而言，海马体照相馆的主要受众群体还是以大学生为主的“90后”以及“00后”消费群体。从感情需要层面来说，“90后”和“00后”年轻人在情感上会更加细腻一些，更希望获得别人的关注。新生代年轻人在学业、工作上的压力是全方位的，主流的价值观无法理解新生代的思维方式，线上线下他们的生活被割裂成两种完全不同的状态。线下个体的意识被压抑，线上对于个体自由的追求就有多热烈。因此，新生代顾客更追求个性化与人性化的服务，追求一种更具仪式感的生活，他们注重分享与表达不愿意随大流。针对新生代顾客的情感需求特点，海马体照相馆从情感品牌、情感产品及服务、情感广告、情感环境四个方面以情动人，牢牢抓住新生代顾客的心。（三）以情感为主题进行市场营销组合设计。1．情感品牌。海马体，是人类大脑中的负责长时记忆储存转换机能的大脑边缘系统的组成部分。日常生活中的短期记忆都储存在海马体中，经过海马体转存的信息会成为长久记忆。海马体照相馆取名的初衷，是想让自己的企业像海马体一样，通过影像服务为人们记录人生当中的每一个重要时刻，用影像承载更多的记忆和情感，倡导更具“仪式感”的生活。海马体照相馆以此命名自己的品牌正暗合了年轻人内心的愿望，记录了年轻人的所有发生过的美好，尊重了他们对生活中仪式感的追求。2．情感产品及服务。对于新生代来说精致的证件照代表的是一种生活态度，想时时刻刻把自己最积极的一面展示给别人，生活中的每一件小事都想要认真对待。海马体照相馆主营高品质证件照恰恰契合了新生代这一情感需求。此外，海马体照相馆还根据年轻人的消费心理，定期推出符合节日氛围的套系。比如，圣诞节推出了圣诞老人、麋鹿、公主、精灵、MagicGirl／Boy五个角色的圣诞套系，而且单人、情侣、朋友、家庭，甚至是宠物都有自己相应的拍摄套餐。再比如，海马体照相馆打造“女王照”，发现每个女孩的迷人之处，开启每个女王的真我一面。此外，海马体照相馆还在情感服务上下工夫，推出充满情感和仪式的“生日照”，为顾客送上生日祝福。3．情感广告。海马体照相馆在广告设计上，用温情脉脉的关怀打动消费者。如2018年圣诞照，根据顾客的真实故事，一口气推出了五个短视频：为生活加温的精灵、小丑篇、为职场鼓励的麋鹿、公主篇和为家庭聚能的圣诞老人篇，全方位地抚慰了“空巢青年”焦虑的内心，一经推出便在社交网络上引起了一轮热议。当七大姑八大姨都只关心新生代挣多少钱、有没有男（女）朋友、什么时候生孩子时，海马体照相馆用最直接的方式为年轻人提供全方位、多方面的精神关怀。4．情感环境。海马体照相馆门店形象，是由总部众多优秀设计师亲自操刀设计，融合了平面与空间的概念，坚持简约、时尚的设计风格，选用白蓝为主题色，给人以品质的象征，让照相馆不仅仅是一个留下照片的场所，更是追求品质生活、留下回忆的地方，并且在门店装修上给顾客以美学的视觉享受和消费体验。例如，2016年12月10日，其在武汉汉正街上线的全国第一家金标店开业，全新的店铺形象设计与产品架构，融入咖啡、美甲、花艺、沙龙、阅读打造的艺术美学空间，让富有人文关怀风格的环境引发顾客油然而生亲切感和认同感，继而诱发现实的或潜在的拍摄需求。

四、结论

海马范文篇6

【关键词】造血祖细胞激酶1;反义寡核苷酸;海马；凋亡；大鼠

TheroleofHPK1inischemicbraininjury

LITing,ZHANGGuangyi*

(ResearchCenterforBiochemistryandMolecularBiology,JiangsuKeyLaboratoryofBrainDisease

Bioinformation,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China)

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheroleofHPK1inthepyramidalcellsinCA1regionoftherathippocampusafterbrainischemia/reperfusion.MethodsTransientbrainischemia(15min)andreperfusionwasinducedbythefour-vesselocclusionmethod(4-VO)toestablishratbrainischemiamodel,followedbyreperfusionof0min,30min,3h,6h,24h,3dand5d,respectively.Ratswererandomlyassignedto4groups:sham-operationgroup,ischemia/reperfusiongroup,drugtestgroupandvehiclecontrolgroup.Thedrugtestgroupwasinjectedwith100g/LHPK1AS-ODNs，MS-ODNsintothecerebralventricle,every24hfor3days,and24hafterthefinaladministrationwassubjectedto4-VO.Immunoprecipitationandcresylfastvioletstainingwereemployedtodetecttheexpressionofrelevantmessageproteins,activationandthedeathofthehippocampalneurons.ResultsItwasfoundthatHPK1wasexpressedinrathippocampusneurons.ConclusionsAdministrationofHPK1antisenseoligodeoxynucleotidescansignificantlyprotecthippocampusneuronsfromapoptosiswithoutdose-dependence.

Keywords:HPK1;antisenseoligodeoxynucleotide;hippocampus;apoptosis;rat

造血祖细胞激酶1（hematopoieticprogenitorkinase1，HPK1orMAP4K1）是造血系统特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于哺乳动物Ste20相关蛋白激酶的MAP4K家族［1］。HPK1主要在造血组织和细胞中表达。大量研究结果表明，HPK1参与许多信号级联反应，包括MAPK(mitogen-activatedproteinkinase)信号、抗原受体信号、凋亡信号、生长因子信号以及细胞因子信号等。HPK1存在3种激活方式，即丝氨酸磷酸化、苏氨酸磷酸化或酪氨酸磷酸化，Ling等［2］证明HPK1含有13个潜在的酪氨酸磷酸化位点，在造血系统内当其中某些酪氨酸磷酸化位点被ZAP-70(Zeta-chain-associatedproteinkinase70)激活后，HPK1将提供含有SH2结构域的蛋白质锚定位点。当HPK1的379位（小鼠）/381位（人类）酪氨酸残基被磷酸化而激活后，HPK1具有了和SLP-76（SH2domain-containingleukocyteproteinof76kD）结合的能力。当HPK1被完全激活后，它可以选择性地激活JNK(c-JunNH2-terminalkinase)的MAPK信号通路［3］。1996年应用PCR技术将HPK1从小鼠造血祖细胞中克隆出来后，研究表明HPK1主要在造血组织和细胞中表达，目前对于HPK1的研究主要集中在造血系统。本研究旨在探讨HPK1是否存在于大鼠海马神经元中及其在缺血性脑损伤中的作用。

1材料和方法

1.1实验动物及材料清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重250～300g，徐州医学院实验动物中心提供。

anti-HPK1（一抗）由SantaCruz公司提供；二抗（驴抗羊）和标准牛血清白蛋白购自美国Sigma公司。醋酸纤维膜（NC膜）为AmershanBiosciences公司产品；NBT/BCIP为Promega公司产品；其他试剂为国产分析纯。

电动匀浆器购自美国Glas-Col公司，Z252MK台式高速冷冻离心机购自德国HERMLE公司。

HPK1反义寡核苷酸序列（AS-ODNs）5′-AGGGTCCACGACGTCCATCC-3′、HPK1错义寡核苷酸序列（MS-ODNs）5′-CACAGCGTCGTACCCGCAGT-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2四动脉阻断全脑缺血模型按Pulsinelli法［4］进行。

1.3动物分组及处理随机分组：①Sham组，手术不缺血；②脑缺血/再灌注组（I/R组），脑缺血15min后再灌注30min、3h、6h、24h、3天、5天；③溶剂对照组（TE组），脑室注射Tris-EDTA，连续3天，在最后一次注射24h后进行缺血/再灌注；④错义寡核苷酸组（MS组），脑室注射MS-ODNs，方法同TE组；⑤反义寡核苷酸组（AS组），脑室注射AS-ODNs，方法同TE组。

1.4脑室注射参照文献［5］方法。

1.5海马CA1区HPK1检测

1.5.1样品制备大鼠缺血15min再灌注30min、3h、6h、24h、3天和5天时，断头快速取脑，分离双侧海马。按文献［6］方法制备海马CA1区组织总蛋白。

1.5.2蛋白含量测定按Lowry等［7］方法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.5.3免疫印迹法蛋白样品（50μg/L）经SDS-PAGE分离后，以半干转法转移至NC膜，室温封闭4h(1﹪BSA,10mmol/LTris，10mmol/LNaCL，0.1﹪Tween20)，加入一抗，4℃过夜。用洗涤液洗膜，加入相应二抗，37℃保温2h，封闭液洗膜。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。

1.6缺血/再灌注5天海马CA1区组织学观察大鼠脑海马CA1区组织学切片制备参照文献［6］方法。

在高倍镜下观察海马CA1区神经元，有清楚的细胞核、胞体着色良好的计为存活神经元，神经元存活程度以CA1区1mm长度内成活的大锥体神经元数量表示。

1.7统计学处理数据以±s表示，2组间数据比较采用新复极差法，多组间数据比较采用单因素方差分析（AZOVA）,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大鼠脑缺血/再灌注不同时间的HPK1免疫印迹分析结果如图1所示，在缺血/再灌注不同时间海马CA1区都可以检测到HPK1的表达。

2.2缺血/再灌注5天后海马CA1区组织学观察Sham组海马CA1区锥体细胞核圆而苍白；I/R组海马CA1区锥体细胞胞体皱缩，细胞核固缩；AS组锥体细胞形态保持较好。图2。

（焦油紫染色，×40，×400）AS组海马CA1区存活的神经元数量较I/R组、TE组、MS组明显增多；I/R组、TE组、MS组海马CA1区存活的神经元数量相近（P＞0.05）。见图3。

3讨论

HPK1是一个97×103的丝/苏氨酸蛋白激酶，它在淋巴细胞中对于调节JNK细胞信号通路起着重要的作用［1］。大量的研究结果证明，HPK1主要在造血组织和器官中表达。但在神经系统中HPK1起着什么样的作用至今未见报道（网络检索）。HPK1的N末端由1个Ste-20样激酶结构域、4个脯氨酸富集motif、1个caspase切割位点组成，C末端为1个Citron同源结构域［2］。Hu等［8］发现造血祖细胞瞬时表达HPK1可以通过MLK3-MKK4/7-JNK信号通路激活JNK，但不能激活ERK或p38-MAPK信号通路。Kiefer等［1］报道HPK1可以通过它的第3和第4个脯氨酸富集区与MLK3的SH3结构域相互作用。在体外实验中，HPK1通过磷酸化MLK3的丝氨酸281位而激活MLK3继而激活JNK。本室早期的研究结果也证实MLK3在大鼠瞬时脑缺血中发挥着重要作用，在缺血15min再灌注6h时其磷酸化水平达到高峰［5-6］。于是，我们提出HPK1是否也参与了脑缺血/再灌注所引起的神经元死亡的细胞信号转导通路呢？

因此，我们首先通过免疫沉淀技术检测了在大鼠海马神经元细胞中HPK1的表达。结果证实在大鼠海马神经元细胞中存在HPK1的表达。既然HPK1在大鼠海马神经元细胞中有表达，那么它有何作用呢？为了回答这一问题，我们设计了HPK1的反义寡核苷酸（HPK1AS-ODNs），脑室注射HPK1AS-ODNs预处理组大鼠海马神经元与I/R组相比明显降低了脑缺血/再灌注所诱导海马神经元死亡。以上结果证明，HPK1存在于大鼠海马神经元，并且HPK1AS-ODNs对缺血/再灌注所引起的CA1区神经元缺失有保护作用。

本实验首次在整体水平证实HPK1存在于大鼠海马神经元细胞中，并且发现我们设计的HPK1的反义寡核苷酸对于对缺血/再灌注所引起的CA1区神经元缺失有保护作用。这对今后我们进一步研究HPK1在全脑缺血中的作用及其分子机制提供了新的思路。

【参考文献】

［1］KieferF,TibblesLA,AnafiM,etal.HPK1,ahematopoieticproteinkinaseactivatingtheSAPK/JNKpathway［J］.EMBOJ,1996,15(24):7013-7025.

［2］LingP,YaoZ,MeyerCF,etal.Interactionofhematopoieticprogenitorkinase1withadapterproteinsCrkandCrkLleadstosynergisticactivationofc-JunN-terminalkinase［J］.MolCellBiolo,1999,19(2):1359-1368.

［3］ArnoldR,LiouJ,DrexlerHC,etal.Caspase-mediatedcleavageofhematopoieticprogenitorkinase1(HPK1)convertsanactivatorofNFkappaBintoaninhibitorofNFkappaB［J］.JBioloChem,2001,276(18):14675-14684.

［4］PulsinelliWA,BrierleyJB.Anewmodelofbilateralhemisphericischemiaintheunanesthetizedrat［J］.Stroke,1979,10(3):267-272

［5］GuZ,JiangQ,ZhangG.c-JunN-terminalkinaseactivationinhippocampalCA1regionwasinvolvedinischemicinjury［J］.Neuroreport,2001,12(5):897-900.

［6］PeiDS,SunYF,GuanQH,etal.Postsynapticdensityprotein95antisenseoligodeoxynucleotidesinhibitstheactivationofMLK3andJNK3viatheGluR6.PSD-95.MLK3signalingmoduleaftertransientcerebralischemiainrathippocampus［J］.Neuroscienceletters,2004,367(1):71-75.

海马范文篇7

【关键词】杏仁核；场电位；长时程增强

0引言

杏仁核与学习记忆、情绪、情感密切相关［1］，而且参与精神分裂症、抑郁、癫痫和创伤后应激障碍等多种神经系统疾病的病理过程［2-3］.然而杏仁核深藏于大脑深部，被复杂精细的神经结构包绕［4］，很难直接探测到杏仁核神经元的活动.脑片是研究杏仁核功能比较理想的标本.脑片上记录神经细胞的活动方式主要有膜片钳、传统的细胞内和场电位记录，前两者对仪器设备要求较高，而场电位记录对设备要求相对简单，并可以反映神经细胞的功能状态，易于推广.我们采用国内的设备系统，制备杏仁核脑片，在脑片上记录场电位,观察其药理学特性并引导杏仁核的长时程增强（longtermpotentiation，LTP），以探讨杏仁核场电位的记录及其应用.

1材料和方法

1.1材料健康SD大鼠24只，雄性，体质量200～250g（福建医科大学实验动物中心），所有动物均在12h光照/黑暗周期环境中饲养，自由摄食及饮水.D，L2氨基5磷酸基戊酸(APV),氰基2硝基喹啉2，3二酮(CNQX),谷氨酸(美国Sigma公司)；微电极放大器,RM6240数据采集系统（成都仪器厂），其余化学产品均为国产分析纯.

1.2方法

1.2.1杏仁核脑片制备将SD大鼠以氟烷麻醉后断头，迅速取脑，放置在低于4℃的冰冷人工脑脊液中并进行修块.人工脑脊液中各种离子成分及其浓度(mmol/L)为：NaCl124，KCl3.0，CaCl21.5，MgCl21.5，NaH2PO31.25，NaHCO325,葡萄糖11.人工脑脊液始终充以950mL/LO2和50mL/LCO2，pH7.2～7.4.用振动切片机把含有杏仁核或海马的大脑部分切成脑片（横切面），厚度500μm.脑片实验记录前在常温人工脑脊液中孵育至少1h.

1.2.2杏仁核脑片场电位记录将脑片移至界面型记录槽(自制)，通过尼龙网与槽内人工脑脊液接触，以1～2mL/min持续灌流脑片,脑脊液温度控制在(30±1)℃，用950mL/LO2和50mL/LCO2混合气体弥散在脑片周围.在解剖显微镜下将双极不锈钢刺激电极置于外囊，记录微电极置于基底外侧杏仁核(basolateralamygdale,BLA)区，其尖端置于脑片表面下约200μm处.刺激电极与记录部位之间的距离约为2mm.微电极内充灌3mol/LNaCl溶液，阻抗为2～5MΩ.场电位经微电极放大器放大后，输出信号用数据采集系统RM6240进行信号的记录、分析和处理.场电位记录基线稳定20min后才开始下一步的实验.场电位的斜率用平均基础值标准化.常规刺激的单相方波信号由RM6240的程控刺激器产生.刺激方波的波宽为0.1ms，频率为0.1Hz，并调整刺激强度使突触反应等于最大突触电位的一半.LTP的引导应用两串频率为100Hz的高频刺激，每串持续1s，串间隔为10min.记录海马场电位时刺激电极放置于海马（cornuammonis1,CA1）区的Schafer侧支通路上，记录电极位于海马CA1区.

1.2.3药物加入实验过程中应用的药物均加入到灌流脑片的人工脑脊液中.

统计学处理:采用SPSS10.0统计分析软件进行数据录入和整理，实验数据用x±s表示，组间采用方差分析.P<0.05为差异具有统计学意义

中国论文联盟-【摘要】目的：探讨基底外侧杏仁核（BLA）离体脑片场电位的记录及其应用.方法：制备杏仁核脑片，在脑片上记录场电位,观察其药理学特性并引导杏仁核的长时程增强（LTP）.结果：在脑片保持良好活性及记录系统噪音幅度小于0.01mV的前提下，应用国产微电极放大器及记录系统即可记录到稳定可靠的杏仁核场电位,大小约为海马CA1场电位的1/10；在灌流液中加入α氨基羟甲基恶唑丙酸（AMPAR）受体拮抗剂氰基2硝基喹啉2，3二酮（CNQX）10μmol/L和N甲基D天冬氨酸（NMDAR）受体阻断剂D，L2氨基5磷酸基戊酸(APV)100μmol/L后，场电位几乎完全被阻断.应用两串高频刺激（间隔10min）刺激外囊，在BLA可引导LTP.结论：杏仁核脑片可记录到稳定可靠的场电位，适用于研究杏仁核的突触可塑性等功能及探讨杏仁核在神经疾病中的作用及其机制.

【关键词】杏仁核；场电位；长时程增强

0引言

杏仁核与学习记忆、情绪、情感密切相关［1］，而且参与精神分裂症、抑郁、癫痫和创伤后应激障碍等多种神经系统疾病的病理过程［2-3］.然而杏仁核深藏于大脑深部，被复杂精细的神经结构包绕［4］，很难直接探测到杏仁核神经元的活动.脑片是研究杏仁核功能比较理想的标本.脑片上记录神经细胞的活动方式主要有膜片钳、传统的细胞内和场电位记录，前两者对仪器设备要求较高，而场电位记录对设备要求相对简单，并可以反映神经细胞的功能状态，易于推广.我们采用国内的设备系统，制备杏仁核脑片，在脑片上记录场电位,观察其药理学特性并引导杏仁核的长时程增强（longtermpotentiation，LTP），以探讨杏仁核场电位的记录及其应用.

1材料和方法

1.1材料健康SD大鼠24只，雄性，体质量200～250g（福建医科大学实验动物中心），所有动物均在12h光照/黑暗周期环境中饲养，自由摄食及饮水.D，L2氨基5磷酸基戊酸(APV),氰基2硝基喹啉2，3二酮(CNQX),谷氨酸(美国Sigma公司)；微电极放大器,RM6240数据采集系统（成都仪器厂），其余化学产品均为国产分析纯.

1.2方法

1.2.1杏仁核脑片制备将SD大鼠以氟烷麻醉后断头，迅速取脑，放置在低于4℃的冰冷人工脑脊液中并进行修块.人工脑脊液中各种离子成分及其浓度(mmol/L)为：NaCl124，KCl3.0，CaCl21.5，MgCl21.5，NaH2PO31.25，NaHCO325,葡萄糖11.人工脑脊液始终充以950mL/LO2和50mL/LCO2，pH7.2～7.4.用振动切片机把含有杏仁核或海马的大脑部分切成脑片（横切面），厚度500μm.脑片实验记录前在常温人工脑脊液中孵育至少1h.

1.2.2杏仁核脑片场电位记录将脑片移至界面型记录槽(自制)，通过尼龙网与槽内人工脑脊液接触，以1～2mL/min持续灌流脑片,脑脊液温度控制在(30±1)℃，用950mL/LO2和50mL/LCO2混合气体弥散在脑片周围.在解剖显微镜下将双极不锈钢刺激电极置于外囊，记录微电极置于基底外侧杏仁核(basolateralamygdale,BLA)区，其尖端置于脑片表面下约200μm处.刺激电极与记录部位之间的距离约为2mm.微电极内充灌3mol/LNaCl溶液，阻抗为2～5MΩ.场电位经微电极放大器放大后，输出信号用数据采集系统RM6240进行信号的记录、分析和处理.场电位记录基线稳定20min后才开始下一步的实验.场电位的斜率用平均基础值标准化.常规刺激的单相方波信号由RM6240的程控刺激器产生.刺激方波的波宽为0.1ms，频率为0.1Hz，并调整刺激强度使突触反应等于最大突触电位的一半.LTP的引导应用两串频率为100Hz的高频刺激，每串持续1s，串间隔为10min.记录海马场电位时刺激电极放置于海马（cornuammonis1,CA1）区的Schafer侧支通路上，记录电极位于海马CA1区.

1.2.3药物加入实验过程中应用的药物均加入到灌流脑片的人工脑脊液中.

统计学处理:采用SPSS10.0统计分析软件进行数据录入和整理，实验数据用x±s表示，组间采用方差分析.P<0.05为差异具有统计学意义.

中国论文联盟-结果

2.1杏仁核与海马场电位的比较海马CA1区场电位的幅度为(1.46±0.10)mV（n=10，图1）.BLA的电位为(0.13±0.05)mV（n=9），其放大倍数为海马的10倍，杏仁核的场电位只有海马CA1场电位的1/10.

2.2杏仁核场电位的药理学特性在灌流的人工脑脊液中加入0.1μmol/L谷氨酸,可见场电位明显增大，洗去谷氨酸后场电位基本恢复至基线的水平(图2A).灌流液中加入α氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)受体拮抗剂CNQX10μmol后，场电位的幅度显著下降，进一步加入N甲基D天冬氨酸(NMDA)受体阻断剂APV100μmol后，场电位几乎消失,洗去CNQX和APV后，场电位基本恢复至加药前的水平(图2B).

2.3杏仁核LTP的诱导在场电位记录稳定10min后，间隔10min应用两串高频刺激外囊，同时观察场电位幅度和斜率的变化情况.BLA场电位的幅度和斜率的变化趋势一致(表1)，两串高频刺激后，场电位明显增大，之后场电位逐渐下降，高频刺激15min后场电位基本稳定，但仍显著大于基础值（n=9,P<0.01）,这种增强作用持续30min以上.通过对场电位斜率用基础值标准化后，可见两串高频刺激后30min增强的场电位的斜率仍然维持在基础值的(146.1±6.9)％(n=9,P<0.01，图3).表1两串高频刺激前后场电位幅度和斜率的变化

3讨论

杏仁核又称杏仁复合体，是大多数哺乳类动物共有的结构，位于颞叶内.杏仁核可分为许多大小不等的核团，通常将这些核群分为皮质内侧群、基底外侧核群和前杏仁区、皮质杏仁移行区两大过渡区［4］.杏仁核与皮层和皮层下结构有着广泛的纤维联系，随着神经科学的发展，杏仁核的功能倍受关注［5］.然而由于解剖结构的关系，很难通过电生理的手段直接记录到在体动物杏仁核的神经细胞的活动，而且在体实验易受到血压、呼吸和血脑屏障等的影响.脑片标本具有有序的神经元和纤维排列及比较完整的神经解剖通路，可在解剖显微镜下直接定位，便于电生理操作，脑片能够复制出整体动物大多数电生理现象，模拟在体实验，因而脑片是研究杏仁核功能的比较理想的标本.

脑片上应用场电位记录的方法研究神经细胞的活动多数是在海马上进行［6］.有研究［7］报道，通过记录杏仁核的场电位研究杏仁核功能，然而这类研究都是在国外的研究室开展，而且实验仪器都是国外生产，价格昂贵.我们应用国产SWF2W微电极放大器和RM6240记录系统，价格便宜，而且可以稳定地记录到杏仁核的场电位.杏仁核的神经细胞分布较稀疏，场电位小，大约只有海马的1/10，实验中要求信号的放大倍数为记录海马CA1的10倍.由于信噪比小，因此记录稳定的杏仁核场电位难度极大.在脑片保持良好活性的前提下，记录系统要求抗干扰强，噪音的幅度应小于0.01mV.记录系统具有良好的屏蔽和接地后，如果还有比较大的50Hz的噪音，可使用噪音消除器去除该频率的干扰，但又不影响信号本身的提取.在脑片保持良好活性及记录系统具有很强的抗干扰作用的情况下，只要信号放大到一定程度，就可以在杏仁核记录到场电位.

在杏仁核的脑片上，刺激外囊可以在BLA记录到突触后反应，来自皮层的神经纤维经外囊投射至BLA，刺激外囊可模拟皮层的兴奋输入［8］.由皮层投射到BLA的纤维主要是谷氨酸能神经元，BLA记录到的主要是兴奋性的突触后电位.在灌流液中加入谷氨酸，场电位明显增大；加入AMPA受体阻断剂CNQX后，场电位的幅度显著降低，进一步加入NMDA受体拮抗剂APV后，场电位几乎完全被阻断，洗去阻断剂后场电位基本恢复，提示外囊至BLA的突触联系主要以谷氨酸为神经递质，由AMPA受体和NMDA受体介导，以前者为主.也提示在灌流液中加入药物，通过观察药物对场电位的作用探讨药物对杏仁核功能的影响.

脑片场电位常用于研究海马的突触可塑性如LTP和LTD，LTP和LTD被认为是学习记忆的基本机制［9］.研究表明杏仁核参与情绪情感相关的学习与记忆过程，提示杏仁核的场电位有可能诱导出LTP.结果表明，我们的实验系统在杏仁核可以诱导出LTP,实验中相隔10min予以外囊高频刺激，观察到记录的BLA场电位的幅度和斜率均明显增大，而且持续时间在30min以上.杏仁核的LTP可能参与了学习与记忆的过程，杏仁核的场电位记录有助于研究杏仁核的突触可塑性.

综上所述，在杏仁核脑片上建立稳定的场电位记录方法，有利于研究杏仁核的功能、观察药物对杏仁核的作用以及探讨杏仁核在精神疾病中的作用及其机制.

【参考文献】

［1］MurrayEA.Theamygdala,rewardandemotion［J］.TrendsCognSci,2007,11(11):489-497.

［2］李涛，王晓峰，李拴德，等.精神分裂症患者额叶至杏仁核径路中电阻值变化规律的观察［J］.第四军医大学学报，2003,24（1）:54-55.

［3］LeDouxJ.Theamygdala［J］.CurrBiol,2007,17(20):868-874.

［4］SwansonLW,PetrovichGD.Whatistheamygdala?［J］.TrendsNeurosci,1998,21(8):323-331.

［5］LangPJ,DavisM.Emotion,motivation,andthebrain:Reflexfoundationsinanimalandhumanresearch［J］.ProgBrainRes,2006,156:3-29.

［6］HessG.Fieldpotentialrecordingforinvestigationofsynapticplasticityinvitro［J］.PostepyHigMedDosw,2000,54(3):299-306.

［7］AlexandraK,GalRL.Effectsofstressandcorticosteroneonactivityandplasticityintheamygdale［J］.JNeurosciRes,2006,84(7):1580-1587.

海马范文篇8

【关键词】银杏叶提取物；学习记忆；乙酰胆碱酯酶；胆碱乙酰转移酶；点燃模型；大鼠

EffectofextractsofGinkgobilobaleafonthelearning-memoryabilityandtheactivity

ofAChEandChATinthehippocampusinratswithkindling-inducedepilepsy

DUANFangrong,YUANBaoqiang*

(DepartmentofPediatrics,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China)

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofextractsofGinkgobilobaleaf(EGb)onthecognitivefunctionssuchaslearningandmemoryabilitiesandpossiblemechanismsinyoungratswithkindling-inducedepilepsy,andontheactivityofacetylcholinesterase(AChE)andcholineacetyltransterase(ChAT)inrat.Methods40postnatalday21(P21)and40postnatalday35(P35)Sprague-Dawley(SD)ratswererandomlyassignedrespectivelyinto5groups:normalsaline(NS)control,kindlingepilepsymodel,high,middleandlowdosageofEGb-treatedkindlingepilepsyafterpreliminaryscreeningbyY-mazetest.Thekindlingmodelwasestablishedbyanintraperitonealinjectionofpentetrazole(PTZ).Thevariationsoflearning-memoryabilityandtheactivityofAChEandChATinthehippocampuswereobservedbyY-mazetestandbiochemistrydetermination.ResultsEGbcouldobviouslyimprovetheachievementofY-mazetestofthekindlingmodelinadose-dependentmanner,withtheactivityofAChEandChATinthehippocampusinhibitedandincreased,respectively.ConclusionEGbcanimprovelearning-memoryabilityinepilepticratsofdevelopmentalphasebyincreasingtheChATactivityandreducingtheAChEactivity,whichmaycontributetoitsactioninimprovingtheabilityofcholinergicnervoussystem.

Keywords:extractsofGinkgobilobaleaf;learning-memory;AChE;ChAT;kindlingmodel;rats

银杏叶提取物(extractsofGinkgobilobaleaf,EGb)是从银杏叶中利用醇溶液提取出的混合成分，主要含有银杏总黄酮苷、银杏内酯和有机酸等，具有多价性药理作用［1］。其作为一种中枢神经赋活剂，目前国内外已将EGb广泛应用于治疗脑动脉硬化、脑梗死后遗症和老年神经精神症状如注意力不集中、记忆力减退、意识模糊等，在临床上明显地改善了脑功能不全患者的学习记忆能力，因而被认为是一种“认知增强剂”［2-4］。目前认知问题亦是癫疒间儿童在临床诊断和治疗中的常见症状，但尚缺乏较好的处理措施。而关于EGb对癫疒间患者尤其是癫疒间儿童学习记忆等认知功能障碍影响的实验研究或临床研究少见报道。本研究旨在探讨EGb对癫疒间模型幼鼠认知功能的影响及可能机制，为临床应用EGb治疗癫疒间儿童认知功能障碍提供实验依据。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物21、35日龄SD幼鼠，体重55～95g，雌雄不分，由徐州医学院实验动物中心提供。

1.1.2药物及试剂EGb（银杏总黄酮苷＞24%，银杏内酯＞6%，峰比0.8～1.0,银杏酸＜1×10-6%），由徐州富伟生化制品有限公司惠赠；戊四氮(PTZ)购于Sigma公司；AChE、ChAT试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3仪器Y型电迷宫，张家港生物医学仪器厂生产；GL20C超速冷冻离心机，武汉科学仪器厂生产；752紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产;水浴箱，上海医学仪器厂。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立参考文献［5］方法。用PTZ亚惊厥剂量（32mg/kg）,腹腔注射,每天1次,连续注射28天。停药1周后,再用相同剂量的PTZ测试。癫疒间发作行为按Racine标准分为6级,即：0级，未发作；Ⅰ级，头面部抽搐；Ⅱ级，肌阵挛、跳起,但无直立；Ⅲ级，肌阵挛,双前肢抬起伴有直立；Ⅳ级，强直-阵挛性惊厥；Ⅴ级，全身强直-阵挛性惊厥伴有翻滚、跌倒。凡显示连续5次2级以上惊厥的大鼠,被认为达到点燃标准，即点燃模型制备成功。

1.2.2动物分组及药物处理先用Y型电迷宫初步筛选21、35日龄大鼠各40只，然后进行点燃模型的制备，造模成功后随机分为5组(n=8)：生理盐水组(NS组)、点燃对照组(PTZ组)、EGb大剂量300mg/kg治疗组(PTZ+EGb1组)、EGb中剂量200mg/kg治疗组(PTZ+EGb2组)、EGb小剂量100mg/kg治疗组(PTZ+EGb3组)。EGb以5%的乙醇为溶剂制备成10%的混悬液，采用灌胃给药,NS组和PTZ组给予相同体积的生理盐水,每日1次，连续给药7天。所有大鼠均在同一实验室和动物中心操作和饲养，以保持喂养、光照、噪声等条件相同。

1.2.3学习记忆功能的训练与评定参照王跃春［6］方法，电流强度0.7mA，电压50V，电击延时5s。

筛选：将大鼠放入Y型迷宫箱中适应3min后，给予适当电击，至其对3臂均探索进入为止，选择活跃、对点击反应较敏感、逃避反应迅速者供测试用。淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠。

训练及评定：采用随机休息不固定训练次数法，以大鼠在足底通电后15s内一次性进入安全区的反应为正确,直至大鼠在连续10次电击中有9次或以上正确（9/10标准）为达到学会标准，以每只大鼠达学会标准所需电击次数表示大鼠的学习记忆成绩。所有训练在1个实验日内完成。各组在造模后次日及治疗后7天进行认知功能的评定。

1.2.4海马AChE、ChAT活性的测定在完成认知功能评定步骤后断头处死大鼠,冰台上迅速取脑并剥离海马,用滤纸吸去海马上的血液,精密称重,脑重∶生理盐水以1∶9比例加入4℃生理盐水制成脑匀浆,3000r/min离心10min,取上清液待测。

海马AChE、ChAT活性的测定严格按试剂盒说明进行，752型紫外分光光度计进行比色。脑组织蛋白测定采用考马斯亮兰试剂盒。

设定每毫克组织蛋白样本在37℃保温6min,水解反应体系中1μmol基质为1个AChE活力单位；在pH7.2条件下，25～30℃时每分钟转移1nmol乙酰胆碱的能力定义为一个ChAT活力单位。

1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，所有计量资料数据以±s表示；多组间的比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，治疗前后的比较采用配对t检验（Paired-SamplesTTest）,不同日龄组的比较采用独立样本t检验(Independent-SampleTTest)；P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1点燃模型的建立PTZ腹腔注射1周左右大鼠陆续出现程度不等的疒间性发作,为Ⅰ～Ⅲ级,以后发作程度逐渐加剧,在连续注射28天后所有大鼠均达到点燃标准。大鼠的疒间性发作基本上在每次腹腔注射PTZ后5～6min出现,一般在10min左右达到高峰,高峰过后时而表现安静,时而有阵发性阵挛,一般30min后很少再有抽搐发作。PTZ点燃成功的大鼠,有慢性、自发性、复发性的发作过程。

2.2各组大鼠行为学测试Y型电迷宫测试结果见表1。

2.2.1治疗前不管是21日龄还是35日龄的大鼠，PTZ各组与其同龄NS组相比，达到学会标准所需的电击次数明显增多(P<0.01)，而PTZ各组之间没有明显差异(P>0.05)；21日龄与35日龄的PTZ各组相互比较，前者达标次数亦明显增多(P<0.05);21日龄与35日龄的NS组相互比较差异无统计学意义。表1各组大鼠Y型电迷宫试验达标所需电击次数与NS组比较：*P<0.01；与治疗后PTZ组比较：#P<0.01；与PTZ+EGb2组比较：※P<0.01；与同组治疗前比较：☆P<0.05；与21日龄组比较：△P<0.05。

2.2.2治疗后2个日龄EGb治疗组达到学会标准的次数均明显少于同龄PTZ组(P<0.01)；同龄EGb大、中、小剂量治疗组相互比较,达到学会标准的次数随EGb治疗剂量的减少逐渐增多，呈现剂量依赖性递增(P<0.01)；各EGb组的2个年龄段之间却未示明显差异(P>0.05)。

21日龄、35日龄各组治疗前后相互比较，EGb各剂量治疗组治疗后达标次数均明显少于治疗前(P<0.01或P<0.05)；NS组、PTZ组治疗前后差异无显著性统计学意义。

2.3生化检测不管是21日龄还是35日龄的大鼠，PTZ组与各自的NS组比较，海马AChE、ChAT的活性都明显降低(P<0.01)；各EGb治疗组与其同龄PTZ组相比，随治疗剂量的增加，AChE活性逐渐降低、ChAT活性则逐渐提高，呈剂量依赖性(P<0.01)；各组的2个年龄段之间AChE、ChAT的活性均未示明显差异(P>0.05)。见表2。表2各组大鼠海马AChE、ChAT活性的比较与PTZ组比较：☆P<0.01；与PTZ+EGb2组比较：△P<0.01；与21日龄PTZ组比较：▲P>0.05

3讨论

点燃模型作为一种最常用的癫疒间动物模型,具备慢性、自发性和复发性特征,点燃一旦建立,动物的这种脑细胞及惊厥行为敏感性可长期维持及至终身,较好地模拟了人类癫疒间的进行性发展和长期反复的自限性发作形式。许多研究表明，不同形式癫疒间发作过程中常伴有海马结构内选择性神经元脱失、苔藓纤维出芽(sprouting)和特异性突触重建等形态学改变［7-9］，在人类复杂部分性发作和儿童期癫疒间患者亦可观察到同样的变化［10］,这表明点燃与人类癫疒间的形成可能有共同的机制，因此点燃模型是研究慢性癫疒间较理想的动物模型。临床资料显示癫疒间患者中30%～40%存在认知功能障碍［11］，在儿童患者更为显著，临床上表现为某种程度的学习困难或学习不能、语言能力的损伤等，但临床上对此缺乏有效的手段来改善这一现状。

本实验采用戊四氮化学点燃方法,复制出了接近人类癫疒间的慢性癫疒间模型，本实验的行为学观察结果发现:点燃组大鼠学习记忆能力显著低于NS组,与文献报道结果相似，说明本造模法稳定可靠,适用于学习记忆等高级神经功能活动的研究。试验结果还显示，21日龄模型鼠的行为学指标与35日龄的相比，差异具有显著性，与以往研究结果相一致，即癫疒间幼鼠起病越早，对学习记忆等认知功能损伤越严重［12］。

目前认为中枢胆碱能系统与学习记忆功能的关系极为密切，有资料表明,海马的胆碱能系统直接参与信息的储存和回忆。而AChE及ChAT是胆碱能神经元的标志酶，两者共同维持着中枢胆碱能系统重要的神经递质——乙酰胆碱（ACh）的动态平衡,在多种高级脑功能包括学习记忆过程中发挥重要作用，所以用AChE及ChAT的活性来反映胆碱能系统的功能较为可靠。许多药理学及临床研究已证实海马和新皮层的胆碱能损伤可以损害大鼠和人的记忆功能。我们的研究显示,点燃大鼠的学习记忆能力明显减退,同时伴有海马AChE、ChAT活性降低,提示戊四氮诱导的学习记忆障碍与海马及新皮层胆碱能系统的功能降低有关，这与以往的研究结果一致。在应用银杏叶提取物EGb治疗后发现，EGb显著改善了癫疒间鼠的学习记忆功能，还显著降低AChE的活性，增强ChAT的活性，并且在100～300mg/kg范围内，EGb的这种药理作用呈剂量依赖性增强。表明EGb能改善癫疒间大鼠学习记忆功能的机制可能与抑制脑AChE活性、增加ChAT的活性,从而提高ACh含量,增强中枢胆碱能神经系统的功能有关。诸多的研究显示，EGb还可能通过促进大脑海马胆碱的再摄取、减少M型胆碱受体和肾上腺素受体及递质的丢失、促进大脑循环代谢、增强胆碱能神经元神经营养因子受体的敏感性等途径发挥改善学习和记忆能力的功能［13］。近年来的临床研究也发现EGb可明显改善血管痴呆患者的智能障碍，这种作用可能与EGb加速神经冲动的传导,易化突触传递,从而有利于信息获得、记忆巩固和再现有关［14］。本实验中2个不同年龄段对应组间生化指标比较未示显著差异，说明除胆碱能系统外可能还有其他机制影响癫疒间幼鼠的学习记忆功能。

本实验结果提示：EGb可以通过抑制学习记忆功能脑区AChE活性、增强ChAT活性、增强中枢胆碱能神经系统的功能来改善点燃模型幼鼠的学习记忆功能障碍，为EGb用于临床治疗癫疒间儿童认知功能障碍提供了理论和实验依据，并且进一步拓展了EGb的药用价值。

【参考文献】

［1］危华玲.银杏叶提取物和山楂提取物的药理作用研究进展［J］.海峡药学，2006，18（2）：5-7.

［2］汪建龙.银杏叶提取物在心脑血管疾病上的临床应用概况［J］.时珍国医国药,2003,14（4）:243-244.

［3］GertzHJ,KieferM.ReviewaboutGinkgobilobaspecialextractEGb761(Ginkgo)［J］.CurrPharmDes,2004,10(3)：261-264.

［4］WangY,WangL,WuJ,etal.TheinvivosynapticplasticitymechanismofEGb761-inducedenhancementofspatiallearningandmemoryinagedrats［J］.BrJPharmacol,2006,148(2)：147-153.

［5］王丽，OnoJ,WalsonPD.大鼠戊四唑点燃模型的建立［J］.药学学报,1993,28(7):486-489.

［6］王跃春.Y型电迷宫在大鼠学习记忆功能测试中的合理应用［J］.中国行为医学科学，2005，14(1):69-70.

［7］刘月影，袁宝强.c-fos反义寡聚核苷酸对癫疒间发作后细胞凋亡的影响［J］.实用儿科临床杂志，2006，21（15）：1017-1018.

［8］陈静，袁宝强.戊四氮诱导发育鼠癫疒间持续状态后海马突触素的变化及MK-801的影响［J］.徐州医学院学报，2006，26（2）：120-124

［9］MortazaviF,EricsonM,StoryD,etal.Spatiallearningdeficitsandemotionalimpairmentinpentylenetetrazole-kindledrats［J］.EpilepsyBehav,2005,7(4):629-638.

［10］MohamedA,WyllieE,RuggieriP,etal.Temporallobeepilepsyduetohippocampalsclerosisinpediatriccandidatesforepilepsysurgery［J］.Neurology,2001,56(2):1643-1649.

［11］洪霞，黄茂盛，王蓓.癫疒间患者的认知功能状况分析［J］.临床神经电生理学杂志，2002，11（2）：88-90.

［12］HermannB,SeidenbergM,BellB,etal.Theneurodevelopmentalimpactofchildhood-onsettemporallobeepilepsyonbrainstructureandfunction［J］.Epilepsia，2002,43(9):1062-1071.

海马范文篇9

额叶是大脑发育中最高级的部分，它包括初级运动区、前运动区和前额叶(prefrontalcorte,PF)，其中PF与认知功能关系密切。前额叶又分为眶部、背部、内侧部和外侧部，其中眶部和内侧部、背部和外侧部的结构和功能较为接近。

PF与大脑其它区域有着密切关系。PF和所有的感觉区都有往返的纤维联系，其眶后部和腹内侧部有投射到海马旁回和海马前下脚的纤维，组成了内侧颞叶-间脑系统的一部分；PF与纹状体、杏仁核、颞叶、枕叶和顶叶等脑区的联系也很密切〔1，2〕，因此，PF与多种感觉信息的加工、记忆、思维及情绪等脑的高级功能有关。从细胞水平来看，PF神经元具有多感觉性质，它们参与多种信息的加工；同时，PF神经元具有柱状组织，表现为功能异质性，如一些PF神经元在延缓反应的延缓期放电明显增加，而另一些神经元对行为的其它特性更为敏感〔3〕。PF神经元的这些结构和功能上的特点是其在记忆中起重要作用的神经基础。

行为研究也证实PF与记忆功能有密切关系，包括工作记忆、源记忆、顺序组织、前摄抑制释放(PI)能力、抑制无关信息的干扰、元记忆、组织和计划有意识的活动、问题解决等〔1，2〕。West〔4〕认为PF的功能包括：(1)工作记忆；(2)期待性记忆，依据工作记忆对相应的内外线索反应；(3)控制干扰，抑制与任务无关的表征；(4)抑制优势反应，使行为不受先前反应或主要的环境刺激影响。功能(1)，(2)，(4)由背外侧前额叶(dPFC)支持，功能(3)主要由PF眶部或内侧部完成。West的这一观点可以说明一些与前额叶有关的行为特点，如选择与任务相关的信息，将语义和时空信息结合成稳定的记忆痕迹，计划、组织复杂行为等，因而具有一定的参考价值。

1与额叶有关的老年记忆功能障碍

记忆障碍是正常老年人的常见主诉，老年人的再认和回忆等测验成绩均较年轻人低。但不同形式的记忆下降并不一致，老年人的外显记忆下降大于内隐记忆；在外显记忆中，再认成绩又好于自由回忆。老年记忆障碍与前额叶受损、内侧颞叶受损的表现有许多相似之处，其中，越来越多的证据表明，老年记忆力下降与额叶功能有密切关系〔5～7〕，PF参与的记忆功能比其它脑区，如内侧颞叶系统支持的记忆功能更早下降。一项研究证明，在12项测定PF功能的测验中，平均年龄为56.62岁的被试有10项比27.71岁的成绩差〔4〕。

1.1工作记忆工作记忆又称短时记忆，它的作用是在编码和提取时暂时保持信息，因而在学习记忆等高级认知活动中起重要作用。测定动物记忆能力常采用延迟反应、延迟转换反应和延缓不匹配任务(DNMS)等。研究表明，老年动物的延迟反应成绩降低，老年鼠在DNMS作业中与额叶受损的大鼠表现相似。对老年人的研究也表明其工作记忆容量减少，工作记忆能力下降。Kirasic等〔8〕采用路径分析的方法，对398例老年人的神经心理学测验进行统计后认为，老年人学习能力是因为工作记忆容量减少和信息加工速度减慢所致，前者又是后者的原因之一。

而研究指出，工作记忆主要与前额叶有关，因此老年工作记忆能力下降的神经基础在前额叶〔9〕。一项PET研究发现，在完成位置匹配时，老年人比青年人在枕叶外的区域如PF、顶叶的下部及内侧部的活动明显增多，提示老年人的枕区活动效率下降，工作记忆容量减少，因而加工信息则可能需要比年轻人更多的脑区参与〔10〕。

1.2源记忆和记忆的顺序组织老年人对刺激的内容和线索的回忆能力是不同的，其源记忆发生障碍〔11，12〕。源记忆是指对事件发生的时间、地点等线索信息的记忆。老年人可以记住某一刺激，但与年轻被试相比，他们对刺激的颜色、字体、声音等知觉特性、刺激发生的时间、地点及其它线索的回忆率下降。一项研究采用元分析方法将有关的实验进行综合统计，结果提示，老年人对线索的回忆成绩低于对事件本身的回忆，与刺激相关较大的线索回忆要好于那些相关较小的，如对颜色的回忆要好于对视空线索的回忆〔13〕。至少有三种原因造成了上述结果，老年人的注意分配能力降低、工作记忆下降及对无关刺激的控制能力下降。在有多个外部线索时尤其需要工作记忆的参与，以使它们与事件内容更好地结合在一起。

有学者认为，对事件的内容和线索的加工分别由不同的脑区所中介，内侧颞叶系统主要加工事件信息，而PF与线索的加工相关较大。相关研究也表明，额叶受损的病人对事件线索的回忆下降，而老年人与之有相似的特征〔8〕。Craik〔11〕的研究还表明，老年人对线索回忆的线索下降与WCST成绩明显相关，并且与内侧颞叶的功能分离。

与源记忆相似，老年人在顺序组织词、图形或活动的任务中受损。给老年人呈现两组刺激，测验时要求他们判断呈现的词或其它刺激哪一个是较近期见过的，他们的成绩与正常年轻人相比差异显著；或者要求老年人按顺序回忆刚才见过的刺激时，他们的成绩也较差，而相应的再认和自由回忆成绩可能接近正常〔19〕。老年人完成这类任务时与Korsakoff症病人(KS)有相似的特点。给KS病人及对照组被试呈现1940～1985年间发生的15个重要事件，然后要求他们顺序回忆出来，结果KS病人的成绩较差，但再认和回忆成绩与对照组相比并无明显差异〔5〕。

1.3控制干扰的能力老年人抑制无关信息的能力也减弱，研究表明，老年人的Stroop效应较大，这提示老年人对先前的优势反应不能很好地控制，以较快地转换行为方式。另一些学者采用从前摄抑制(PI)中释放的实验范式，给被试呈现相同或不同类别的词表，在每一词表呈现后要求他们回忆，相同类别的词表间会有干扰，但若词表间类别不同，被试的回忆成绩要增高。与额叶受损病人相似，老年人的PI释放能力下降，他们抑制先前学习过程的词表的能力较低，语义类型转换较慢，如延迟反应、DNMS等。Shimamura〔1〕认为，PF对其它部位的信息加工具有抑制门控作用，实验也证实动物后皮质区活动减少与dPFC的活动增多有关。但有研究表明，海马受损被试的PI释放能力下降更为明显〔5〕，因此PF与内侧颞叶系统在这项能力上是否相互独立尚待研究。

1.4策略运用及对记忆的监控当回忆需要一定的策略参与时，老年人的测验成绩比年轻人低，如回忆非组块词表、低频词时。一项实验采用3组实验材料，非相关的词表、相关但顺序是随机的词表、使用组块的词表，要求老年人和额叶受损病人回忆，结果表明，老年人学习词表的能力中度受损，尤其是那些需采用策略的测验，如未使用组块的词表，这和额叶受损，尤其是右侧额叶受损病人的表现较为一致，提示老年人的自我组织能力下降，不能运用恰当的策略去完成任务〔4〕，而这种功能缺陷与PF功能下降的关系较为密切。

元记忆是对于自己记忆和策略的监控能力，元记忆的测定常采用知道感判断，也有采用其它方法的研究，如要求被选择合适的记忆策略、预测自己的行为、高频估计实验、测验被试的日常生活记忆等。老年人的元记忆能力受到一定程度的损害，他们对自己记忆的估计偏低，自信程度减少，但有关的结果不太一致，可能与测验方法的敏感性有关。PF受损的病人在回忆不出来时，要求他们判断若给出线索，自己能回忆出来的概率，结果他们的估计也较低，虽然他们在其后给出线索后的回忆率与年轻人差异不明显〔5〕。

总之，有些额叶测验成绩与老年人记忆成绩明显相关，老年人记忆功能下降表现为与PF受损相似的特征。近年来，脑功能成像技术已应用于年老化的研究，这对老年认知加工过程与PF的相关性提供了新的依据。Grady等〔15〕的一项研究发现，在完成面孔编码时，年轻被试的右

侧海马、左PF和下颞叶活动增多，老年人的上述变化不明显。当回忆不出所学项目时，年青轻试的额叶前部有活动，而老年人则更倾向于额叶后部，提示他们在提取努力中采用了不同的认知策略，老年人正常的认知策略受损〔6〕。

2PF与老年记忆功能障碍相关性的神经机制

老年人的大脑发生了许多变化，但并不是所有脑结构的变化是同步的，其中一些结构对年老较为敏感，变化较早而严重，如前额叶和海马等。

老年人的脑容量大约减少6%，其中PF和纹状体分别减少10%～17%和8%，而顶、枕和颞叶的容积则大致减少1%，PF对年老最为敏感〔17〕。以往的研究大多采用测定神经元密度的计数方法，认为造成脑容量减少的原因是神经元的缺失，尤其在海马和前额叶，这造成了老年人的记忆功能下降。但近年的研究采用新的细胞计数方法(如立体学技术)并未发现老年脑的神经元有明显减少〔4，7，18〕，因而这并不是老年记忆功能下降的主要原因。

脑容量减少的可能原因是神经元体积变小，而不是神经元的缺失。额叶神经细胞的皱缩比其它部位的发生早且严重，在50～70岁期间PF有22%的细胞皱缩，而顶叶、初级视皮质分别为16%和9%。65岁以上细胞皱缩速度明显增快，上述各部位分别有43%、11%和13%的细胞体积减少〔17〕。另外一些学者认为，多巴胺系统(DA)的退化也参与老年记忆功能降低，多巴胺系统功能与工作记忆之间有相关性〔7〕。有研究证实老年脑的额叶神经递质浓度及受体异常〔4，19〕。18岁龄猴子的PF中DA浓度下降56%，NE及5-HT浓度正常，PF和D1受体下降39%。当给动物注射D1受体阻滞剂SCH23390后，年轻动物的延缓反应成绩下降，对老年动物无作用；而注射D1受体兴奋剂会提高老年动物在此项任务中的成绩〔18〕。因此新的研究认为，树突分枝减少、突触联系的变化、髓鞘结构破坏、信息传递机制异常和神经元的可塑性降低等更可能是老年记忆功能下降的原因〔7，18〕，其中额叶变化最为明显。

3对今后研究的思考

如上所述，多项研究证实老年记忆障碍与额叶功能有密切的关系。但另一方面，海马功能降低和PF功能下降有时很难区别，在很多任务中常常是这两个脑区同时参与其中。一些研究认为，不同的认知任务中均有联想性和策略性两种因素。前者主要与内侧颞叶有关，而后者与PF有密切联系〔5〕，二者可以发生分离，如WCST与延迟线索回忆，但实际上很难将二者的作用绝对区分开来。Winocur等〔19〕的研究很好地说明了这一点。他们的实验采用Hebb-William迷宫，发现PF受损后主要影响大鼠一般迷宫技能认知，它们可以保持在迷宫A中学习的技能，但当转换至迷宫B时其学习成绩与对照组无明显差异；而海马受损则影响与特定迷宫有关的记忆功能，其行为表现与PF受损的大鼠相反。而老年鼠在这两方面均受损，因而它们可能在PF和海马均有损害。老年人在许多记忆任务中未表现出海马与前额叶功能的双分离现象，而仅仅是单分离并不能说明PF功能的独立性。

因此，目前在研究老年记忆障碍与PF的关系时，对于是否PF单独支持这些功能还是海马等结构也共同参与尚待进一步研究。而且在完成记忆任务时，不同脑区的作用可能既有分离、更有相互作用。如在Moscovitch和Winocur提出的记忆模型中，是将海马和PF的功能结合起来考虑的。这种观点对于我们认识记忆过程的脑机制很有帮助。

PF的特点之一是功能的多样性。根据脑血流变化和脑代谢活动分析，PF至少有17个功能不同的区域，但额叶受损病人的受损部位常常很大，并不局限于单一的基本功能〔7〕，因此，研究老年记忆障碍与PF的相关性具有一定的困难。另外，以人作被试，个体间的差异是误差的重要来源，而由于这类病人本身就很少，仅仅靠增加样本量的方法是不可行的。因而研究额叶功能应采用动物实验模型、神经心理学方法和脑功能成像技术相结合的途径，从不同方面揭示老年记忆障碍的脑基础；同时采用生理、生化手段将PF的内部构造进行结构和功能分析，会使我们对PF功能及它在老年记忆障碍中作用的认识大大前进一步。

参考文献

1ShimamuraAP.Memoryandfrontallobefunction.InMgazzaniga(Eds)，Thecognitiveneurosciences，Cambridge:MITPress,1994：803-813

2PetridesM.Frontallobesandmemory.InBollerF,GrafmanJ(Eds)，HandbookofNeuropsychology(Vol.3).NewYork，Oxford:Amsterdam,ELSEVIER,1992：75-90

3Goldman-RakicPS.Modularorganizationofprefrontalcorte

x.TrendsNeurosci，1984：419

4WestRL.Anapplicationofprefrontalcortexfunctiontheorytocognitiveaging.PsycholBull，1996；120(2)：272

5MoscovitchM，WinocurG.Theneuropsychologyofmemoryandaging.InCraikfIM，SalthouseTA(Eds)，Handbookofagingandcognition,Hillsdale,NJ:Eribaumpress,1992：72

6GallagherM，RappPR.Theuseofanimalmodelstostudytheeffectsofagingoncognition.AnnuRevPsychol，1997；48：339

7ParkinAJ，WalterBM.Recollectiveexperience,normalaging,andfrontaldysfunction.PsycholAging，1992；7(2)：290

8KirasicKC，AllenGL,DobsonSHetal.Aging,cognitiveresources,anddeclarativelearning.PsycholAging，1996；11(4)：658

9D''''EspositoM，DetreJA,AlsopDCetal.Theneuralbasisofthecentralexecutivesystemofworkingmemory.Nature，1995；378：279

10GradyCL，MaisogJM,HorwitzBetal.Age-relatedchangesincorticalbloodflowactivationduringvisualprocessingoffacesandlocation.JNeurosci，1994；14(3)：1450

11CraikFIM，MorrisLW,MorrisRGetal.Agingsourceamnesiaandfrontallobefunctioning.PsycholAging，1990；5：148

12GliskyEL，PolsterMR,RouthieauxBC.Doubledissociationbetweenitemandsourcememory.Neuropsychology，1995；9：229

13SpencerWD，RazN.Differentialeffectsofagingonmemoryforcontentandcontext:ameta-analysis.PsycholAging，1995；10(4)：527

14GradyCL，McLntoshAR,HorwitzBetal.Age-relatedreductionsinhumanrecognitionmemoryduetoimpairedencoding.Science，1995；269：218

15SchacterDL.Illusorymemories:acognitiveneuroscienceanalysis.Proc.NatlAcadSciUSA，1996；93：13527

16HaugH，EggersR.Morphometryofthehumancortexcerebriandcorpusstriatumduringaging.NeurobiolAging，1991；12：336

17MorrisonJH，HofPR.Lifeanddeathofneuronsintheagingbrain.Science，1997；278：412

海马范文篇10

【关键词】尼莫地平；铝负荷大鼠；单胺氧化酶B

由于阿尔茨海默病（AD）发病机制未明，目前尚缺乏理想的治疗手段。尼莫地平是双氢吡啶类钙通道拮抗剂，脂溶性高，易通过血脑屏障，其扩张脑血管，改善脑血供应等作用已得到肯定并应用于临床，而其对老年痴呆认知记忆障碍的改善作用〔1〕，机制至今仍不很清楚。有研究报道单胺氧化酶B（MAOB）的活性改变与神经元损伤和神经元退变可能有密切关系〔2，3〕。为探讨尼莫地平在改善老年痴呆等导致的认知记忆障碍中的作用，本研究拟采用铝负荷大鼠脑损伤模型，观察脑损伤学习记忆障碍与脑组织MAOB改变的关系及尼莫地平对铝损伤大鼠脑组织MAOB表达的影响，为神经元退行性疾病的发病机制研究奠定实验与理论基础，为防治药物的开发探寻新方法与新途径。

1材料与方法

1.1动物与分组清洁级3月龄Wistar大鼠100只，雄性，180～220g，由重庆医科大学动物实验中心提供〔动物生产许可证号:SCXK(渝)2005002〕。按体重随机分成3组，每组10只，即空白对照(溶剂为0.5%羧甲基纤维素钠)组，铝模型(AlCl3400mg/kg)组与尼莫地平组(80mg/kg)，灌胃容积1ml/100g体重。在实验过程中，铝模型组死亡2只鼠。

1.2方法

1.2.1试剂、药品与仪器AlCl3·6H2O和葡萄糖酸钠为国产分析纯，临用前用蒸馏水配制；尼莫地平(重庆科瑞制药厂)，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠配制；乙酰胆碱转移酶(ChAT)、胆碱脂酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、MAOB试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RTPCR试剂盒（日本TaKaRa）、RNATriol、单去污剂裂解液、考马斯亮蓝、封闭液与辣根过氧化物酶等。DTT2型大鼠跳台仪(中国医学科学院药物研究所)、DMS2型电脑全自动程控Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)、高速冷冻离心机(美国Sigma公司)、UV265紫外分光光度计(日本岛津公司)、PCR扩增仪(美国genecycleTM，BioRad公司)与凝胶电泳成像分析系统(美国BioRad公司)等。

1.2.2模型制备采用AlCl3(400mg/kg)灌胃大鼠，1次/d，5d/w，持续3个月，建立铝负荷致大鼠慢性脑损伤的动物模型。

1.2.3检测指标

1.2.3.1训练次数与跳台潜伏期分别在给予药物3月后次日，用跳台法测定每组大鼠被动回避性学习记忆能力。先将动物放入反应箱中适应1min，然后通以电压为36V的交流电5min，大鼠遭受电击会跳上安全平台，而走下平台后会再次遭受电击，记录5min内大鼠受电击次数，作为大鼠学会逃避电击的学习能力。24h后测定大鼠的记忆成绩，把大鼠置于安全平台上，记录大鼠第一次跳下平台的时间即潜伏期，以此潜伏期作为大鼠的记忆成绩，超过5min记为5min。

1.2.3.2寻台潜伏期每组大鼠在完成被动回避性学习记忆能力测试后，用Morris水迷宫法进行大鼠空间定向能力测试。水温24～25℃。整个训练过程分为2个阶段：第1阶段，第1次训练时将大鼠放到平台上适应1min，后让其自由游泳至平台，3min内未找到平台者，实验者协助将其引至平台，从第2天起，每天分上、下午分段训练，每段训练4次，每次训练时选择1个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，让大鼠进行定向航行，持续训练4d；第2阶段，即在第5天时进行测试，撤去平台，并任意将大鼠从最后一次训练时的入水方位放入，电脑记录大鼠第1次跨越原平台的时间即寻台潜伏期(Stepdownlatency，SDL)，以此潜伏期作为大鼠的空间定向能力成绩，超过2min以2min计算。

1.2.3.3脑组织ChAT、AchE、SOD活性和MDA含量测定在完成全部行为学测试后，处死大鼠，分离其海马，用生理盐水做成10%匀浆，按相关试剂盒说明书进行具体操作。

1.2.3.4脑组织MAOB活性、mRNA及蛋白表达水平的检测10%海马及皮质组织匀浆各取0.1ml，按照MAOB试剂盒说明书中的操作步骤测定MAOB活性。参照大鼠MAOB基因库，根据cDNA设计引物，引物由北京鼎国生物技术发展中心合成，用来扩增535bp的MAOB片段。另外从北京鼎国生物技术发展中心购买GAPDH引物一对作为内参照，用来扩增983bp的GAPDH片段。MAOB的上游引物为5′TGCTAGATAAGATCTGCTGG3′；下游引物为5′ATCCAATGTGTACGCAATTG3′；GADPH的上游引物为5′TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGGC3′；下游引物为5′CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3′；PCR反应条件为95℃5min预变性，95℃1min、60℃55s与72℃90s，27个循环，72℃10min。扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳，BioRad凝胶成像分析系统成像与分析。Western印迹测定MAOB蛋白表达水平，以βactin为参照，辣根过氧化物酶系统显色，用可见紫外光凝胶扫描分析系统对蛋白条带进行分析。

1.3统计学处理结果用x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行方差分析，组间差异采用Dunnett方法进行显著性检验。

2结果

2.1铝负荷大鼠脑组织生化指标的变化及尼莫地平的影响与空白对照组比较，铝模型组大鼠脑组织的ChAT与SOD活性明显降低，AchE活性与MDA含量显著增高（均P＜0.01）。与铝模型组比较，尼莫地平组大鼠脑组织的ChAT与SOD活性明显增加，AchE活性与MDA含量显著降低（均P＜0.01）（表1）。

2.2铝负荷大鼠学习记忆功能的变化及尼莫地平的影响与空白对照组比较，铝模型组大鼠5min内学会逃避电击而需要的电击次数明显增加，而跳台潜伏期明显缩短，寻台潜伏期明显延长（均P＜0.01）。与铝模型组比较，尼莫地平组大鼠学会逃避电击而需要的次数明显减少(P＜0.01)，而跳台潜伏期明显延长，寻台潜伏期明显缩短（均P＜0.01）（表2）。

2.3铝负荷致大鼠脑组织MAOB活性与表达变化及尼莫地平的影响与空白对照组比较，铝负荷组大鼠脑组织MAOB活性与MAOBmRNA及蛋白表达均显著增高（均P＜0.01）。与铝模型组比较，尼莫地平组大鼠脑组织MAOB活性与MAOBmRNA及蛋白表达均显著降低（均P＜0.01）（表3）。表1尼莫地平对铝负荷大鼠脑组织ChAT、AchE、SOD活性与MDA含量的影响表2尼莫地平对铝负荷致大鼠学习记忆能力与空间识别能力损害的影响与铝模型组比较：1）P＜0.01，下表同表3尼莫地平对铝负荷大鼠脑组织MAOB活性与表达的影响

3讨论

转基因方法可以建立AD大鼠模型，并能较好地模拟AD特征改变，但建模时间长，成本昂贵，很难广泛用于研究〔4〕。动物脑室注射、腹腔给予或者长期口服铝盐，铝可在脑皮层各区以及海马异常沉积，引起动物学习记忆功能的进行性损害和神经元退变〔5〕。因此，本室采用AlCl3(400mg/kg)持续灌胃大鼠的方法，建立铝负荷致大鼠慢性脑损伤模型。ChAT的表达和活性降低以及AchE活性的升高会造成乙酰胆碱含量下降，进而出现学习记忆功能障碍。因此ChAT和AchE表达和活性改变是AD等神经元退行性疾病特征变化之一。本研究中，铝模型组大鼠脑组织ChAT活性降低，AchE活性升高，同时大鼠被动回避性学习记忆能力与空间识别能力损害，故此法建立神经元退变大鼠模型是成功的。

关于铝致神经毒性，特别是致神经元退变的机制，目前尚不完全清楚。本实验结果显示，慢性铝负荷可导致大鼠海马SOD活性降低、MDA含量升高，提示与其他原因所致脑损伤相似，氧化应激也参与了慢性铝负荷致脑损伤、神经元退变过程。

本实验发现铝负荷大鼠脑组织MAOB活性、MAOBmRNA与蛋白表达显著增高，提示铝负荷致大鼠神经元退变的毒性机制也与MAOB活性及表达增加有关。

本结果还发现，尼莫地平能明显改善铝负荷导致的大鼠被动回避性学习记忆能力损害和空间学习记忆障碍，减轻海马神经元损伤，明显增加铝负荷大鼠海马ChAT与SOD的活性，明显降低铝负荷大鼠AchE活性与MDA含量，表明尼莫地平对铝负荷大鼠脑损伤具有保护作用；同时，尼莫地平也能显著降低铝负荷大鼠脑组织MAOB活性，对抗铝负荷引起的大鼠脑组织MAOBmRNA和蛋白表达增加。但尼莫地平对MAOB活性与表达的改变是该药物直接作用引起，还是作为钙通道拮抗剂间接作用所致，尚不清楚，有待深入研究。

【参考文献】

1王玮,付晶晶.尼莫地平的药理作用及临床应用〔J〕.沈阳医学院学报，2000;2(2):1147.

2KurthJH，KurthMC，PodusloSE,etal.AssociationofamonoamineoxidaseBallelewithParkinson′sdisease〔J〕.AnnNeurol,1993;33（4）:36872.

3YangJQ，ZhouQX.Protectiveeffectofnimodipineagainstcerebralinjuryinducedbysubacutecarbonmonoxideintoxicationinmice〔J〕.ActaPharmacolSin，2001;22(5):42337.