小鼠海马蛋白质影响管理论文

【摘要】目的运用蛋白质组学技术观察益智健脑颗粒对SAMP8小鼠海马蛋白质表达的影响，从而探讨益智健脑颗粒治疗阿尔茨海默病(AD)的部分作用机制。方法将6月龄SAMP820只随机分为治疗组(n=10)和对照组(n=10)，治疗组以益智健脑颗粒浓缩液灌胃，对照组以等剂量双蒸水灌胃。8w后，应用双向凝胶电泳(2DE)技术分别分离治疗组和对照组SAMP8海马区组织总蛋白，经胶体考马斯亮蓝染色，利用ImageScanner图像扫描仪及ImageMaster双向凝胶电泳软件对图像进行扫描分析，将有意义的差异蛋白质点经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)分析得到肽质量指纹图谱(PMF)，经MSDB和NCBI数据库查询，鉴定差异蛋白质点。结果鉴定出治疗组13个差异表达大于2倍的蛋白质，其中有8个上调，5个下调。结论益智健脑颗粒可调节SAMP8小鼠海马组织的多种蛋白质表达,提示该药具有多靶点治疗的作用。

【关键词】益智健脑颗粒；SAMP8小鼠；海马；双向凝胶电泳；质谱分析

益智健脑颗粒是董克礼教授多年临床实践治疗阿尔茨海默病(AD)的中药处方，临床上用于治疗AD之肾虚血瘀型,取得满意疗效〔1〕，动物实验研究能改善SAMP8小鼠的学习记忆能力〔2〕。本研究则在临床观察及前期动物实验的基础上，应用蛋白质组学技术鉴定益智健脑颗粒干预前后P8品系快速老化小鼠(SAMP8)海马组织的差异表达蛋白质，试图从蛋白质组水平探讨中药益智健脑颗粒治疗AD的作用机制，为临床用药提供理论依据。

1材料与方法

1.1动物及分组选用6月龄20只雄性SAMP8小鼠，随机分为治疗组和对照组,每组各10只，由天津中医学院附属第一医院动物部提供。

1.2药物、试剂与仪器益智健脑颗粒由淫羊藿、锁阳、川断、田七等组成，其水提浓缩液，相当于1ml含3g生药，由湖南德康制药有限公司加工制成。双向凝胶电泳试剂：2DQuantKit蛋白定量试剂盒，尿素，硫脲，NP40，TritonX100，二硫苏糖醇，碘乙酰胺，固相pH梯度干胶条（pH3～10，24cm），IPG缓冲液（pH3～10），两性电解质（pH3～10），覆盖液，双向凝胶电泳标准蛋白质，考马斯亮蓝G250,溴酚蓝均为瑞典AmershamBiosciences公司产品；琼脂糖，过硫酸氨,丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，甘氨酸，三羟甲基氨基甲烷，CHAPS和十二烷基硫酸钠，碳酸氢铵，三氟乙酸、乙腈和基质α氰基4羟基肉桂酸均为美国SigmaAldrich公司产品。胰蛋白酶，美国Promega公司产品。PDQuest双向凝胶图谱分析软件是美国BioRad公司产品，MascotMS/MS数据库查询软件是英国Matrixscience公司产品，IPGphor等电聚焦仪，Imagescanner扫描仪均为瑞典AmershamBiosciences公司产品，DataExplorer质谱分析软件，VoyagerDESTR4307MALDITOFMS质谱仪是美国AppliedBiosystem公司产品。

1.3方法

1.3.1动物喂养及标本收集治疗组和对照组小鼠喂养于层流室，温度18～22℃，湿度55%～58%，饮水及饲料高温蒸汽灭菌。小鼠灌胃剂量每天30g/kg计算。治疗组给予中药益智健脑颗粒浓缩液灌胃，1次/d。对照组给予相同体积的双蒸水灌胃，1次/d，持续8w。8w后，迅速断头处死治疗组和对照组小鼠，置于冰上，剥出脑组织，用冷生理盐水冲洗干净，除去血渍，取出所需的海马，置于EP管中，迅速置于液氮中保存。

1.3.2海马组织总蛋白的提取及浓度测定将海马组织从液氮中取出，立即放入预先称重的EP管中进行称重。然后根据50mg样品组织加入约400μl组织裂解液的比例加入组织裂解液（7mol/L尿素、2mol/L硫脲，2%NP40，1%TritonX100，0.5mmol/LEDTA，40mmol/LTris，4%CHAPS，100mmol/LDTT，5mmol/LPMSF）混合后，用研磨工具使海马组织充分研磨裂解，室温下静置孵育1h，间或涡旋混匀，然后1200r/min，4℃离心1h，吸取上清即为组织的总蛋白质。取少许（5μl）上清液（组织总蛋白质）测定蛋白质浓度。采用AmershamBiosciences公司专门针对蛋白质组学研究的蛋白质抽提设计的2DQuantKit定量试剂盒测定蛋白质浓度。

1.3.3双向凝胶电泳每块胶的上样量1500μg。将胶条槽放置于平台上，将样品加入胶条槽中，取出IPG干胶条（pH3～10）置入含蛋白质样品的胶条槽中，再将胶条槽平行放置于IPGphor等电聚焦仪上进行第一向电泳。等电聚焦电泳结束后，将胶条先后放在平衡缓冲A液(平衡缓冲贮液10ml＋DTT100mg)和平衡缓冲B液(平衡缓冲贮液10ml＋碘乙酰胺250mg)中各平衡15min。然后将胶条转移至12.5%的PAGE分离胶上端，进行第二向电泳。

1.3.4图像染色与扫描将凝胶从玻璃板上剥离下来，双蒸水清洗干净后用考马斯亮蓝G250的蓝银染色方法进行蓝银显色，通过扫描仪及扫描软件进行扫描获取图像，使用PDQuest图像分析软件进行凝胶图像分析。

1.3.5质谱分析将蛋白质点从凝胶上切取下来，脱色、酶解后对样品萃取、点样。用MALDITOFMS质谱仪中进行分析，获得肽质量指纹图谱（PMF），再利用NCBI数据库进行检索。

2结果

得到背景清晰、分辨率高、重复性好的2DE图谱各3张。每张2DE图谱约有900个蛋白质点，大多数蛋白质点在位置和丰度上是一致的，主要分布在pH4～8的范围内。选择差异在两倍以上的16个蛋白质斑点作为差异表达的蛋白质点进行质谱分析，最后得到鉴定的差异表达蛋白质点为13个(各个蛋白具体在凝胶上的分布见图1)。这些蛋白质的功能分别涉及到细胞骨架蛋白、代谢相关酶类、信号传导和激素等多个方面。在治疗组中表达上调的有8个，分别为1、2、4、5、9、10、11、13号蛋白，表达下调的有5个，分别为3、6、7、8、12号蛋白。每个蛋白的具体情况见表1。表1差异表达蛋白质信息

3讨论

AD发病机制现存在多种假说：能量代谢障碍、激素缺乏、细胞凋亡、淀粉样蛋白神经毒性作用、炎症、自由基损伤等。本实验鉴定的13种蛋白质点，分别涉及到能量代谢、细胞凋亡、细胞骨架、激素等多个方面。肽酰脯氨酰顺反式异构酶A(Pin1)属于微小菌素蛋白的一种酶，Pin1蛋白是一种相对大分子量(18kD)的肽酰脯氨酰异构酶。Pin1与磷酸化的微管相关蛋白(tau)蛋白结合，而磷酸化的tau蛋白聚集形成神经元纤维缠结，这样就使Pin1过多结合于纤维结上，使可利用的游离Pin1减少或缺乏，从而诱导神经元凋亡，这可能是AD发病机制之一〔3～5〕。有研究表明，外源性Pin1的加入可以恢复tau蛋白使微管聚集的生物学特征，即加入的Pin1与磷酸化的tau蛋白结合，使其异构化，成为磷蛋白磷酸酶2A型(ProteinPhosphatase2A,PP2A)的最适底物，PP2A使tau蛋白去磷酸化，从而恢复tau蛋白使微管蛋白聚集的生物学功能，减少神经纤维缠结的形成〔6〕。磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解的关键酶，PGK基因发生突变会导致智力减退〔7〕，这个酶是一个有重要价值的、具有潜力的药物设计的靶标〔8〕。

近年研究发现，雌激素可通过多种途径和环节影响AD的发生和发展〔9，10〕。流行病学调查表明，绝经后妇女AD的发病率较同龄男性高1.5～3.1倍，原因与绝经后妇女丧失了雌激素的保护作用有关〔11〕。接受雌激素治疗的患者脑血流量增加,尤其是在海马、海马沟回、颞叶等与认知功能相关的脑区〔12〕。大脑的海马区与记忆和学习的关系密切，在此区域发现了大量的雌激素受体(ER)。雌激素α受体主要在海马锥体层神经元中表达，雌激素α受体阳性神经元主要分布在CA3和CA4亚区，而在CA1区较少。AD病理学上的一个重要特征为CA1区较CA3区更易发生神经退变，雌激素α受体分布与AD病理变化部位的高度重合提示雌激素可能参与了AD的发病〔13〕。

中药益智健脑颗粒是由淫羊藿、锁阳、川断、刺五加、柏仁、水蛭、田七等药物组成的复方，适用于肾虚血瘀型的老年痴呆。本实验发现，中药益智健脑颗粒通过改善能量代谢、抑制细胞凋亡、构成细胞骨架、增加激素等多途径、多靶点治疗AD。

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