凝胶色谱十篇

凝胶色谱篇1

【摘要】 目的建立凝胶渗透色谱（GPC）净化-毛细管气相色谱测定中成药中有机氯农药残留量的方法。方法凝胶渗透色谱采用的流动相为丙酮-环己烷 (1∶4)，最佳流速是5 ml/min，最佳馏分收集时间是15～26 min。结果低、中、高3个添加水平的回收率分别为85.5%～115.0%，84.3%～123.4%，86.7%～114.0%，相对标准偏差（RSD）为0.1%～9.3%，检出限0.008～0.05μg/kg。结论该方法简便，分离效果好，灵敏度高，重现性好。

【关键词】 气相色谱 凝胶渗透色谱 有机氯农药 中成药 残留量

有机氯类农药(OCPs)是一类高效广谱杀虫剂，广泛应用于杀灭农业害虫，曾是各国杀虫剂中使用最广泛的一大类。这类农药化学性质稳定，脂溶性强，残效期长，易在脂肪体内蓄积，造成慢性中毒，严重危及人体健康，中药材及中成药的农药残留问题近年来逐渐引起人们的重视。尽快建立中药中农药残留的检测方法及限量标准，对保证人们用药安全具有积极的意义。目前中药材中有机氯农药残留测定主要采用有机溶剂提取，浓硫酸净化，气相色谱分析。但因中药成分复杂，其中农药残留量属痕量范畴，这样使得农药的提取、分离、净化与富集的难度加大。凝胶渗透色谱作为一种自动化的分离技术在农药残留分析中得到了推广和应用［1～7］。本研究运用凝胶渗透色谱替代硫酸净化，有效地克服了硫酸净化回收率偏低的难题，建立的毛细管气相色谱分析方法，具有操作简便、分析速度快、分离效能高、检测灵敏度高等优点，适合于中成药中痕量有机氯农药的测定。

1 材料

Agilent 6890N 气相色谱仪，配备捕获检测器（μ-ECD），安捷伦GC工作站。GPC纯化系统：泵（Waters 515 HPLC Pump ），二极管阵列检测器（Waters 2996 PAD）， 自动馏分收集器（Waters Fraction Collector III），GPC纯化柱（Shodex CLNpak EV2000，20.0 mmID×300 mm），数据处理软件（Waters Empower），5 ml定量环。OV-1701毛细管色谱柱30 m×0.32 mmID×0.32 μm；R210旋转蒸发仪（瑞士BUCHI）；电子分析天平（R200D）。

丙酮、环己烷均为色谱纯（天津科密欧），二氯甲烷为分析纯（天津科密欧）。农药标准品：甲体-六六六（α- BHC）；乙体-六六六（β- BHC）；丙体-六六六（γ- BHC）；丁体-六六六（δ- BHC）；对对位滴滴依（PP`-DDE）；邻对位滴滴涕（OP-DDT）；对对位滴滴滴（PP`-DDD）；对对位滴滴涕（PP`-DDT）；五氯硝基苯（PCNB）。所用标准品由中国成都化学试剂生产，纯度大于99%。用甲醇分别配成0.1 mg/ml的单标储备液，再分别移取一定量的单标储备液于10 ml容量瓶中，用丙酮-环己烷（1∶4）混合液定容，配成混合标准液。

2 方法

2.1 样品的提取 准确称取仙灵骨葆胶囊样品（胶囊直接取其粉末即可，颗粒须经磨碎成粉末） 2.5 g于具塞锥形瓶中，加入10 ml水浸泡过夜或超声30 min，加丙酮30 ml超声30 min，加3 g氯化钠，振摇，再加30 ml二氯甲烷，超声30 min，静置1～2 h，取30 min上清液于100 ml浓缩瓶中，在50℃旋转蒸发浓缩近干，再加丙酮-环己烷（1∶4）混合液5 ml，重复2次，用丙酮－环己烷混合液定容至10 ml，4 000 r/min离心10 min待用。

2.2 GPC凝胶净化实验

2.2.1 GPC洗脱规律实验取5 ml一定浓度的农药混合标准液进样，用Waters 2996 PAD进行全波长扫描，以丙酮－环己烷（1∶4）混合液作流动相， 流量5 ml/ min，每毫升收集于一个试管中，收集30个，用氮吹近干，丙酮－环己烷定容至1 ml得到待测液1。同样在做成药洗脱曲线时，用带0.45 μl尼龙微孔滤膜的10 ml的注射器取样品提取液5 ml过GPC，其余同上，得到待测液2。

2.2.2 GPC净化取“2.1”项的提取液5.0 ml进样到GPC；保持流速为5 ml/ min，收集第15～26 min馏分。浓缩淋洗液，用丙酮－环己烷定容至5 ml待测，得到待测液3。

2.3 GC分析条件Agilent 6890N 气相色谱仪，配备捕获检测器（μ-ECD），ov-1701弹性石英毛细管色谱柱30 m×0.32 mmID×0.32 μm；进样口280℃，柱温220℃，检测器370℃，载气为高纯N2（纯度99.99%），柱前压105 KPa，柱流量1.5 ml/min，进样量1 μl，不分流进样。

3 结果

3.1 净化条件的确定馏分收集时间点的确定要充分考虑被渗透排除的机体组分与混合标准组分的分离情况和回收率。成药样品和农药混合标准经GPC净化后GC-ECD检测结果表明，收集第15～26 min的馏分，成药（仙灵骨葆胶囊，贵州同济堂制药有限责任公司生产）样品净化率可达70%，加标回收率为85%～115%，回收率满足痕量分析的要求，成药样品色谱图见图1。

3.506 min为α- BHC，3.77 min为PCNB，5.94 min为β- BHC

图1 成药样品GC-ECD色谱图

3.2 成药及9种有机氯农药的GPC流出规律GPC是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应进行分离，大分子的油脂、色素(叶绿素、叶黄素)、生物碱、聚合物等先淋洗出来，农药及工业污染物等分子量较小，后淋洗出。GPC凝胶柱对成药以及9种有机氯农药的分离、净化效果进行如下试验。将待测液1分别用Agilent 6890N 气相色谱仪，电子捕获检测器（μ-ECD）检测出各段流出农药的含量，结果见图2。9种有机氯农药在凝胶渗透色谱柱上都是在第15～26 min时流出，但在第15 min仅有δ- BHC和第26 min有PCNB流出少量，所以，在样品基质较复杂的体系中，只需收集16～25 min，这可最大限度去除油脂等杂质的干扰，回收率达到85%～115%。将待测液2分别用Agilent 6890N 气相色谱仪，电子捕获检测器（μ-ECD）检测出各段流出液杂质的含量，结果见图3。成药流出液杂质（油脂、色素、生物碱等）在凝胶渗透色谱柱上是在第10～35 min流出，其中10～15 min时流出 50%的杂质，第15分钟收集的馏分在ECD上响应值最高，第900分收集的馏分在ECD上有响应。

图2 9种有机氯农药的GPC流出规律

图3 仙灵骨葆胶囊的GPC流出规律

3.3 标准工作曲线和方法学评价配制5个不同浓度的混合标准溶液，每个浓度重复3次，取峰面积平均值，得线性回归方程，见表1。有机氯农药标准品色谱图见图4。从表1得出，在一定的浓度范围内，9种有机氯农药的线性关系良好，线性关系系数r（0.998 9～0.999 7）。加标样品按3倍基线-噪声比计算9种有机氯农药的检出限。

3.4 回收率及精密度实验在2.5 g成药样品中加入3种不同浓度（添加水平见表2）有机氯混合标准液，按上述方法进行，同时做空白对照，回收率及相对标准偏差结果见表2，成药加标GC-ECD色谱图见图5。 表2 回收率与精密度测定结果

3.5 样品测定按照本文建立的方法，测定了贵州省出口潜力较大的3种中成药，农药残留测定结果见表3。结果表明，贵州中药有机氯农药的残留自实行中药药材规范化种植以来，中药中有机氯农药污染已得到了控制。表3 3种成药中有机氯农药的残留量mg·kg-1 H1-仙灵骨葆胶囊（批号：060428），贵州同济堂制药有限责任公司生产；H2-抗妇炎胶囊，贵州远程制药有限责任有限公司生产（批号：Z20025698）；H3-妇科再造丸（批号：Z20025056），贵州德昌祥药业有限公司生产。“-”表示未检出

4 讨论

本文以贵州出口中成药仙灵骨葆胶囊为样品，系统地研究了其提取液和有机氯农药的GPC流出规律，建立了仙灵骨葆胶囊中有机氯农药残留的测定方法，并成功地运用于其他中药的测定。建立的GPC净化，气相色谱测定中成药中有机氯农药残留量的方法具有自动化程度高，回收率和净化效率好等优点，适合于大部分中成药中9种有机氯农药的测定。但对于含糖组分较高的中成药，如糖浆类成药，本文建立的样品提取方法不适用，有待进一步研究。

参考文献

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［2］ 刘咏梅， 王志华， 储晓刚. 凝胶渗透色谱净化-气相色谱分离同时测定糙米中50种有机磷农药残留［J］.分析化学，2005，33(6)：808.

［3］ 李 樱，储晓刚，仲维科，等.凝胶渗透色谱气相色谱同时测定糙米中拟除虫菊酯有机氯农药和多氯联苯的残留量［J］.色谱，2004，22（5）：551.

［4］ 曾凡刚.凝胶渗透色谱净化：气相色谱法测定牛奶中10种有机氯农药残留［J］.中国乳品工业，2006，34（5）：52.

［5］ 高梦南，王燕萍，唐红卫，等.凝胶渗透色谱净化在土样有机氯测定中的应用［J］.环境科学与技术，2006，29（3）：38.

凝胶色谱篇2

【关键词】凝胶色谱法；头孢菌素类药物；高分子杂质；测定方法

从现如今我国医药临床研究中可以看出，有些药物对人体会造成一定的过敏性，这和药物中的高分子杂质的含量之间存在着必然的联系。从实际的判断中可以看出，要想保证药品的安全性，药物研究人员应该对高分子杂质的数量进行控制，减少其对人体健康的威胁。为了保证药物的整体质量。工作人员需要对纯度进行测定。工作人员所采用的测定方式就是凝胶色谱法。

一、实验过程中的注意事项

研究人员在对头孢菌素类药物进行测定的过程中，主要采用的是凝胶色谱法。在测定的过程中要经过严格地检定。保证实验操作的规范性和科学性，这样才能够提升测量结果的精准度。

1、仪器准备

在实验进行之前，做好准备阶段的工作至关重要，在检测之前，工作人员要对实验仪器和设备等进行检测，包括每一个检测单元、输液单元。在检测之后需要做好记录。进行这一环节主要是为了有效的满足紫外检测工作基本要求，提升输液单位的流速，进而在检测的过程中发出相对比较科学的模拟信号。在设备和系统使用的过程中，工作人员主要涉及到液相色谱仪，保证检测的精准度是至关重要的。只有做好定期的检定工作，才能提升实验结果的高效性

2、凝胶色谱柱准备

研究人员在选择色谱柱的过程中，需要将仪器设备的耗能量，溶解能力等方面列入到检测工作的行列中。一般情况下，胶凝色谱柱的体积明显低于柱床的体积。为了满足这一要求，头孢菌素的抗生素高分子杂质所在柱床的体积要达到60ml以上。

3、玻璃柱管的分端凝胶介质的选取

一般来说，在玻璃柱管的分端上会存在着一个玻璃棉在其顶端。如果条件不允许的话可以采用过滤板或者是可以调节的商品玻璃珠管。采用这种方式的过程中，凝胶类型有很多种。其中数量较多的就是采用葡聚糖凝胶。在使用的过程中，工作人员需要做好溶胀工作。根据凝胶柱的体积来计算其余的用量。经过蒸馏水泡过之后，玻璃柱管可以长时间的放置。只需要在热水中煮沸，就可以保证其充分溶胀。需要注意的是，这两种不同的溶胀方式应该将气泡挤压出去，实现真空脱气。

4、装柱

如果凝胶介质经过了充分的溶胀，就需要用蒸馏水来对其悬浮，去除其中的杂质。按照这种方式进行洗涤，直到表面上层的溶液达到澄清状态。通过具体的实践可以看出，凝胶介质可以用水来配置悬浆，然后将其倒入玻璃柱中，直到其完成沉降滞后就可以实现装柱。不仅如此，垂直放置的玻璃珠管应该保持顺畅，在其中加入一定量的凝胶悬浆，可以促进凝胶颗粒沉降的科学性。同时还应该让漏斗保持凝胶悬浆，这种方式在应用等等过程中，装柱之间明显增强，在需要的时候可以采用增加负压的方式来提升装柱时间。

二、系统适用性实验

在实验的过程中，采用系统适用性实验不仅可以提升溶液制备工作的高效性，还可以促进其可操作性。溶液的配置所采用的方式比较简单，主要是实现主成分和杂质的混合配置。

但还是会使得有些杂质对照品不能得到，如性质不稳定或分离提取技术要求太高等，但这些杂质峰恰恰又是与主成分峰最难分离的色谱峰。系统适用性试验目前包括很多内容，主要考察对照品测定系统与高分子杂质测定系统中蓝色葡聚糖2000溶液峰的保留时间的比值，以及理论板数和拖尾因子，以此来控制对照品测定与高分子杂质测定时仪器状态的同一性。

三、操作方法上的注意事项

1、样品溶液及对照溶液的制备

具体操作中必须要按规定的标准来配制样品溶液，由于某些高浓度抗生素溶液具有一定的不稳定性，所以通常对样品溶液采取即溶即进的形式。对照溶液的制备上，要注意头孢菌高分子杂质的含量测定，通常以样品自身在SDS水溶液或纯水中的缔合物作为对照进行定量。在制备缔合物时特别要注意对浓度及水的纯度的控制，以此来保证缔合完全。

2、进样及进样方式

一般在对头孢菌素高分子杂质含量进行测定时，通常需要不同状态的流动相，选择出合适的对照溶液进行进样。因此，只有事先将流动相更换之后，才能充分保证凝胶色谱柱的平衡性。并且，笔者建议尽量采用凝胶色谱仪自动进样方式，或是在特殊情况下，选择手动进样。然而，无论是任何一种进样方式，在实验中，都必须保证色谱柱端无缝隙处，从而避免样品扩散，影响分离效果。另外，在对头孢菌素高分子进行自动取样的过程中，也要切实遵守相关的液相色谱操作规程。

3、凝胶面的平整

如果选择了手动进样方式，就一定要保证凝胶表面的平整性和完整性。并在进样之前，事先使用滴管吸取掉凝胶表面积压的液体，确保色谱柱下端能够顺利流通，直到色谱柱内的溶液流降到凝表面时，我们才可以应用相应的定量器具，对样品溶液进行精密的量取。之后，我们还需要将样品溶液滴加到色谱柱的凝胶表面中，同时还要对色谱柱管内壁上残留的样品溶液进行清洗。最后，也是最重要的一个实验环节，相关实验人员要在色谱柱顶端缓慢注入适量的流动相，认真做好进样时间的记录工作。

4、记录对照及结果

要分别记录样品和对照溶液的色谱图，积分对照溶液的峰面积和样品溶液中处于外水体积的高聚物杂质面积，按外标法以峰面积计算样品中高分子杂质的含量。按平行实验的平均值作为样品中高分子杂质含量的最终结果，并与标准规定限度比较后作出是否符合规定的判断。

5、样量分析

在一般高效液相色谱仪上使用凝胶柱，应严格限制泵压。由于一般高压液相色谱管路和检测器通路狭窄，极易发生堵塞，所以要注意尽量减少将出柱液连接到检测器的时间，尤其是新填充的色谱柱更应经水或流动相充分平衡后再连接到检测器。

四、结束语

通过实验结果表明，大部分抗生素药物中的高分子杂质已经超出了药物本身的杂质，严重影响了药物质量，残留了部分污染物质，再加之抗生素在贮存过程中，其分子很容易发生聚合反应，最终产生大量的聚合物杂质，大大降低了药品的纯度。因此，采用高效的凝胶色谱法对头孢菌素中的高分子杂质含量的测量是非常至关重要的，操作人员必须严格遵守相应的检测要求，加强对凝胶色谱法的合理运用及改进，进一步提高头孢菌素类型药物的质量和纯度，从而达到理想的治疗效果。■

参考文献

[1]乔海灵，赵永星，马统勋.青霉素类抗生素过敏反应机制及诊断的新近研究进展[J].国外医药（抗生素分册）.2012（05）

凝胶色谱篇3

【关键词】 盐酸头孢吡肟 凝胶色谱法 高分子杂质

Abstract:Objective To establish a method for determining high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection. Methods Quantification of high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection was determined by Sephadex G10 column chromatography with external standard method. The mobile phase consisted of 0.1 mol／L phosphate buffer(pH7.0) and supper pure water．The flow rate was 1.0 mL／min and detection wavelength 254 nm. Results The content of high molecular weight impurities in different batches of cefepime hydrochloride injection was less than 0.5％．Conclusion This method was sensitive and accurate for determining high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection.

Key words: cefepime hydrochloride; sephadex G-10; high molecular weight impurities

注射用盐酸头孢吡肟（cefepime hydrochloride）是20世纪90年代上市的第四代头孢菌素，本品抗菌谱广，药效强。实验研究表明，控制产品中高分子杂质是减少β-内酰胺类抗生素过敏反应的重要途径之一 ［1］。《中国药典》2005年版采用凝胶色谱自身对照外标法定量测定β内酰胺类抗生素中的聚合物，而盐酸头孢吡肟不能完全缔合，无法采用“自身”对照外标法定量，根据《中国药典》2005年版二部阿莫西林聚合物检验方法，可以用结构与研制产品类似，且能够完全缔合的其他药物制备对照品，进行自身对照外标法定量［2-3］。本文用与头孢吡肟结构及分子量相近的头孢噻肟作对照品，建立了测定注射用盐酸头孢吡肟中高分子杂质(头孢吡肟聚合物)的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DHLA电脑恒流泵(上海泸西分析仪器厂)，UVD6802紫外检测仪(上海金达生化仪器厂)，HW2000色谱工作站(南京色谱软件有限公司)。

1.2 试药

头孢噻肟对照品(批号130483-200102，中国药品生物制品检定所)；注射用盐酸头孢吡肟(批号060330、060731、060830，广州白云山天心药业股份有限公司)。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸、氢氧化钠均为分析纯；水为二次重蒸馏水；葡聚糖凝胶(Sephadex)G10和蓝色葡聚糖2000为Amersham Bioscience公司产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为玻璃色谱柱（40 m×1.5 cm），内填Sephadex G10凝胶；流动相A为pH7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠21.85 g和磷酸二氢钠6.08 g，加水1 000 mL，调pH值为7.0)，流动相B为超纯水；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm。

2.2 系统适用性试验［4］

分别以流动相A、B为流动相，取0.1 mg/mL蓝色葡聚糖2000溶液200 μL注入色谱仪，理论塔板数按蓝色葡聚糖2000峰计算分别为1 968、1 639，拖尾因子分别为1.7、1.1，在两种流动相系统中蓝色葡聚糖2000保留时间的比值为1.01，对照溶液主峰和供试品溶液中聚合物与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值都在0.93～1.07之间，另以流动相B为流动相，精密量取对照溶液200 μL，连续进样5次，峰面积的相对标准偏差为0.35％。

2.3 标准曲线绘制

取头孢噻肟对照品约0.25 g置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液0.5、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分别置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别取上述溶液各200 μL，记录色谱图，以质量浓度(ρ)为横坐标， 峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，回归方程为：ρ=8.714×106A+31788(n=5，r=0.9998)。实验表明，在0.025～0.4 mg/mL质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

2.4 精密度和稳定性试验

配制每1 mL含100 μg的头孢噻肟对照溶液，精密量取200 μL注入色谱仪，连续进样5次，计算峰面积的RSD为0.35％。将测定溶液放置1、2、4 h，分别测定峰面积，计算峰面积的RSD为0.27％。

2.5 检测灵敏度试验

取头孢噻肟对照品适量，精密称定，用水稀释制成一系列浓度的溶液，精密量取上述溶液200 μL注入色谱仪，以流动相B为流动相进行测定，记录色谱图。最小检测限(S/N＝3)为0.025 mg/mL，最小定量限(S/N＝10)为0.076 mg/mL。

2.6 重复性试验

取同一批号样品依法重复测定6次，得高分子杂质含量分别为0.09％，0.1％，0.1％，0.1％，0.1％，0.1％，RSD为4.15％。实验表明方法的重复性良好。

2.7 样品的测定

取头孢噻肟对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.2 mg的对照溶液。取供试品适量约相当于头孢吡肟0.2 g ，精密称定，置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，立即精密量取200 μL注入色谱仪，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图，见图1。另精密量取对照溶液200 μL注入色谱仪，以流动相B为流动相，同法测定。按外标法以峰面积计算，含头孢吡肟聚合物以头孢吡肟计算(头孢噻肟:头孢吡肟＝1.0∶0.94)，3个批号（060330、060731、060830）的样品测定结果分别为0.3%、0.2%和0.1%。

图1 注射用盐酸头孢吡肟高分子杂质检查图谱（略）

Fig.1 Chromatograms of high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection

3 讨论

高分子杂质会随样品放置时间的延长而增加，而高分子杂质是引起β内酰胺类抗生素过敏反应的主要原因之一，故有必要对其进行检测。《中国药典》2005年版标准增强了对高分子杂质检测的要求。本方法按照《中国药典》2005年版标准要求进行研究检测，经试验结果表明，本方法灵敏、准确、简便，可用于注射用盐酸头孢吡肟的质量控制。

【参考文献】

［1］ 李哲媛，李玉凤，范兵. 阿莫西林中高分子杂质的测定与质量分析［J］. 中国现代应用药学杂志，2006，23(4)：326-327.

［2］ 霍秀敏.β内酰胺类抗菌素分子杂质的研究［J］.药品评价，2005，2(5)：324-326.

凝胶色谱篇4

胶原广泛存在于动物体的皮肤、肌腱、韧带、软骨等结缔组织中，是细胞外基质 4 大组分之一，属于一种结构蛋白质。胶原是哺乳动物体内含量最高的蛋白质，占体内蛋白质总量的25% ～ 30%［1 －2］。由于具有独特的三股螺旋结构，赋予了胶原良好的生物相容性、弱抗原性、可降解性等生物学功能。胶原应用于医学材料领域具有得天独厚的条件，如具有良好的生物相容性、较弱的抗原性、亲水性好、利于细胞的粘附，促进细胞生长等［3］。正是由于胶原的应用广泛，作为生物医用材料的潜力巨大，胶原的分离纯化成为了众多学者研究的热点。胶原的结构较为复杂，且不溶于水，导致从动物组织中纯化较为困难。如果胶原中无机盐含量过高，不仅影响纯度，还将会影响其作为止血材料的性能，对创面造成不良的影响［4］。胶原的分离纯化主要有以下特点: 胶原作为一种蛋白质，是具有生物活性的物质，在分离纯化过程中，有机溶剂、溶液 pH 值、环境温度、离子强度的变化等，均可使蛋白质变性失活; 原料的组成非常复杂; 作为医用的生物材料，所要求的产品必须是高度纯化的，且无菌、无致热源等［5］。应用色谱法分离纯化生物大分子，效率高，选择性好。其中又主要以包括凝胶色谱等液相色谱为主［6］。凝胶色谱又叫凝胶层析或凝胶过滤色谱，是混合物随流动相经固定相( 网状孔径) 的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术，通过蛋白质分子大小不同实现分离的。孔径比凝胶大的分子不能进入凝胶内网状结构，而被排阻于凝胶之外，随着溶剂在凝胶之间的空隙向下移动并最先流出柱外; 比网孔小的分子可渗透进入凝胶颗粒内部，再扩散出来，经历的流程长，流动速度慢，后流出［7］。与其他的色谱法相比较，凝胶色谱有其自身的优点，如凝胶过滤的介质价廉易得、可重复再生、溶质与介质不发生相互作用等，适合于规模化的分离纯化。因而在生物大分子分离纯化过程中应用最普遍，尤其是在分离纯化初级阶段及成品化前的脱盐工序被广泛应用［8］。本研究对凝胶色谱法分离纯化胶原进行了探索和试验，通过紫外分光光度计检测收集样品的吸光值的变化趋势，结合电导率的走向，分析胶原的分离效果和除盐效果，为胶原规 模 化 的 分 离 纯 化 奠 定 一 定基础。

1 材料与方法

1． 1 主要试剂与仪器

纯化猪皮［9］，经过一系列物理化学与生物方法处理，除去脂肪、毛发等杂质成分实验室自制而得;葡聚糖凝胶，Dextran Gel G － 25( 粒度 100 － 200 目) ，中 国 长 征 制药厂;牛腱 I 型胶原( 生化级) ，Sigma 公司;三羟甲基氨基甲烷( BR) 、氯胺 T( AR) ，成都科龙化工试剂厂;冰乙酸( AR) ，重庆申渝化学试剂厂;硫酸铵( AR) ，重庆茂业化学试剂有限公司;对二甲氨基苯甲醛，天津新纯化学试剂研究所。精密 pH 计，PHS － 3B，上海雷磁仪器厂;电导率仪，DDS － 307，上海雷磁仪器厂;磁力搅拌器，84 －1A;电子天平，FA2004N，上海箐海仪器有限公司;层析柱，成都蜀都化验设备厂;微量移液器，上海荣泰生化工程有限公司;冷冻干燥机，Freeze 6，Labconca;紫外可见分光光度计 UV751GD，上海分析仪器总厂;傅里叶变换红外光谱仪，NicoletiS10，美国 Thermo Fisher。

1． 2 试验方法

1． 2． 1 凝胶色谱法分离胶原

1． 2． 1． 1 凝胶的预处理

称取适量葡聚糖凝胶 G － 25，加入蒸馏水中; 沸水加热溶胀，然后用浮选法除去小颗粒和碎片。

1． 2． 1． 2 凝胶的装柱

选用柱高 20cm，内径 6cm 的层析柱，排除死体积内气泡，溶胀好的凝胶与洗脱液混合后，缓慢加入到柱体内，将其垂直固定，少量洗脱液冲洗管壁，稳定下沉。

1． 2． 1． 3 粗提胶原的制备

纯化猪皮剪碎，经三羟甲基氨基甲烷 － 氯化钠缓冲溶液浸泡直至皮块稍微溶胀，倾去缓冲液，调节 pH 值 2．5，2% 胃蛋白酶，4℃ 条件下反应 8h( 皮块基本水解完全) ，抽滤得清液，调节 pH 值至 7． 5，硫酸铵盐析，得到胶原粗提物，上样时做适当的稀释。

1． 2． 1． 4 上样

打开柱底出口，放洗脱液至胶床面齐，关闭下口，取稀释后的胶原溶液样品 5mL，使移液管尖端慢慢地沿着管壁，将样品放入床内，再用少量洗脱液冲洗管壁 2 次，保留液面 2 ～ 3mm时开始上样。

1． 2． 1． 5 洗脱、收集样品

每 4mL 收集一管，共收集 30 管。

1． 2． 2 透析方法纯化胶原

将盐析处理的胶原盐溶液过滤，加入适量 0． 2mol/L 醋酸溶液溶解，将此胶原溶液装入透析袋( 截流分子质量 14kDa) ，对 0． 04mol/L 和 0． 02mol/L 的 Na2HPO4溶液各透析 1d，蒸馏水透析 2d，经常换液( 整个透析过程于4℃ 下进行) 。完成后，将透析袋内的样品均匀转移至干净的培养皿中冷冻干燥( 2d，－ 37℃ 真空冷冻干燥) ，得海绵状胶原固体。

1． 2． 3 样品的性能检测

1． 2． 3． 1 紫外检测

将收集的样品于 225nm 处测定吸光值，以管号为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线。

1． 2． 3． 2 电导率测定

测定收集到的样品的电导率，以管号为横坐标，电导率为纵坐标，绘制电导率变化趋势图。

1． 2． 3． 3 傅里叶变换红外光谱检测

红外光谱的形成是以分子的振动为基础，而这些振动可以定位到分子殊的键和基团［10］。因此可以通过红外检测手段对分离样品进行二级结构的表征，检测出胶原特有基团的特征吸收峰。收集到的吸收峰段的试样在 －37℃ 下，真空冷冻干燥 2d。制样采用溴化钾压片，进行检测时扫描波数为450 ～ 4 000cm－ 1，分辨率为 2cm－ 1，每次扫描重复 16 次。

1． 2． 3． 4 羟脯氨酸含量的测定

准确称取羟脯氨酸标准品，加入少许 0. 001mol/L 盐酸溶液，配制浓度分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9 和10mg/L的羟 脯 氨 酸 标 准 液，待 用。以 0．001mol /L 盐酸溶液为空白液，于 2mL羟脯氨酸标准液和空白液中加入 1mL氯胺 T 溶 液，混 合 均 匀，室 温 静 置20min; 加入过氯酸溶液 1mL，室温静置 5min; 加入对二甲氨基苯甲醛溶液1mL，混合均匀; 60℃ 保温 20min 后，立即置于水中冷却; 测定在 560nm 处的吸光值; 以羟脯氨酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。取 0． 5mL 样品溶液和 0． 5mL 盐酸至安醅瓶( 另取 0． 5mL 蒸馏水和 0．5mL 盐 酸 作 空 白 对 照) ，封 管 后 于120℃ 加热 6h 进行水解。调节 pH 值至 4 ～ 6，定容至 25mL 待用。样品的羟脯氨酸含量测定操作方法同标准液的测定方法。

2 结果与讨论

2． 1 紫外分析和电导率分析

试验及文献［11］表明，胶原溶液在225nm 处有强烈的吸收峰，故试验收集样 品 在 225nm 处 检 测 吸 光 值，225nm 处测得吸光值及电导率的变化如图 1 所示。由图 1 可以看出: 在 225nm 处的吸光值先是非常平缓，因为首先流出来的洗脱液中既没有盐也没有溶解的胶原分子，故吸光值较低，且都处在同等水平; 然后吸光值急剧上升到一个平台，保持在一定的水平，说明此刻已经有物质从凝胶色谱柱系统中流出，此物质即为胶原。胶原是大分子物质，不会进入凝胶内部的网状结构，被排阻于凝胶之外，所以会先流出柱体;由于上样量是一定的，当然体系中胶原分子也是一定的，随着胶原逐渐的流出，吸光值也会下降。因此，在出现平台之后，曲线又急剧下降到一定程度，趋于平缓。但是此时的吸光值比初始的吸光值高，说明有一些小分子蛋白的流出，同时开始有盐的流出，这点从电导率的曲线急剧上升可以明显看出。硫酸铵盐是小分子物质，能进入到凝胶内部，渗透进凝胶颗粒的网状结构，故流出较胶原大分子慢。用氯化钡溶液检测硫酸铵盐的存在，结果发现直到第 27 管开始才有沉淀析出，这点与电导率的变化是一致的，进一步证实了之前吸光值变化的结果。由以上分析初步断定第 17 －20 管( 即吸光值变化曲线平台段) 收集的样品为胶原溶液，且没有盐分的存在。

2． 2 红外光谱分析

通过红外光谱的检测，可以反映物质的分子结构，图谱中的吸收峰与分子中的各个基团的振动形式相对应，因此可以得到试样的官能团化学键的基本信息。酰胺Ⅰ带的特征吸收位于 1 600 ～1660cm－ 1左右，是由羰基的伸缩振动引起的强烈吸收。文献［10］表明，α － 螺旋的酰胺Ⅰ带吸收波数范围在 1 650 ～ 1658cm－ 1处。酰胺Ⅱ带的特征吸收峰在1 550cm－ 1附近，与 N—H 弯曲振动和C—N 伸缩振动有关。位于 1 220 ～ 1 330cm－ 1区域的吸收归属于酰胺Ⅲ带，酰胺Ⅲ带的振动能明显区分 α － 螺旋与无规则卷曲这 2种二级结构。另1 450cm－ 1附近的吸收峰是由 C—H 的弯曲振动引起。图 2 中 a 和 b 是凝胶色谱分离得到胶原样品和常规透析方法得到的胶原的红外光谱图，图 3 为 SigmaⅠ型胶原的红外图谱，各吸收峰的归属情况见表1。比较3 条红外图谱可以发现:不论是凝胶色谱分离胶原还是常规透析法制得的胶原，均与 SigmaⅠ型胶原有相似的主要吸收峰。据文献［12］表明，于1 235 ～1 450cm－ 1范围的吸收峰可以表明胶原的三股螺旋结构的存在。图 2a 中波数为 1 239. 37、1 338. 98 和1 404. 83cm－ 1等处存在吸收峰，图2b 中1 240. 8、1 338. 6 和 1 402. 5cm－ 1等处，也同样明显存在吸收峰，图 3 中1 239. 58、1 337. 35、1 402. 49cm－ 1等处存在吸收峰。3 条图谱中在 1 235cm－ 1和1 450cm－ 1附近的吸收峰的吸光度比值均在 0. 9 以上，较接近Ⅰ型胶原特征值1．0，而不是同等条件下的变性胶原和明胶的 0. 59［12］。因此，由红外光谱分析可初步认为凝胶色谱法分离的胶原基本保持了三股螺旋的结构，且与同等条件下常规透析方法纯化得到的胶原和 Sigma 公司的Ⅰ型胶原类似。

2． 3 羟脯氨酸含量分析

羟脯氨酸是胶原的一种特征氨基酸，通过检测溶液中羟脯氨酸的含量，可以较好地反映胶原含量及纯度，按照 Woessner 法( 第 I 法)［13］测定羟脯氨酸 含 量，此 法 操 作 简 单，且 重 复性好。根据此方法测得羟脯氨酸含量为8． 02% ，与文献值［14］7% ～ 14% 接近，基本符合羟脯氨酸在胶原中所占的比例，表明所分离得到的胶原样品的纯度较高，可初步判定应属于 I 型胶原。对于采用凝胶色谱法分离得到的猪皮胶原的结构的分析，还需要进一步通过电泳法，氨基酸全分析、圆二色谱法和原子力显微镜等检测手段加以确证。

凝胶色谱篇5

关键词：HPLC法；阿昔洛韦；眼用凝胶；含量

单纯疱疹病毒性角膜炎又称单疱角膜炎，是由单纯疱疹病毒诱发的角膜感染引起的一类眼科疾病，是目前世界上危害最为严重的眼科疾病之一[1]，阿昔洛韦（aciclovior）因其选择性高、副作用小、药物耐受好且为高特异性抗单纯疱疹病毒药物，成为目前单疱角膜炎最佳治疗药物。早期眼部用药治疗多采用眼膏或滴眼剂，因使用方便、患者接受性好等特点，被广泛应用，但近期研究发现，由于滴眼剂在眼内停留时间较多，且容易被体内吸收，药物生物利用率低，重复多次应用又可能引发较多副作用[2]。凝胶型眼用制剂的出现，有效解决了上述问题。阿昔洛韦凝胶剂可有效解决单疱角膜炎治疗需反复用药、生物利用率低等问题。如何快速测定此类眼用凝胶中主成分含量，有效监测此类药物质量，成为众多药学所关注的问题。

1 材料与方法

1.1仪器与试药 岛津LC-20A型高效液相色谱仪；离心机（北京医用离心机厂）；甲醇、冰醋酸均由国药集团化学试剂有限公司提供，均为色谱醇；阿昔洛韦对照品（中国药品生物制品检定所，批号：150913-151102）；阿昔洛韦凝胶（江苏圣宝罗药业有限公司，国药准字H19991377，批号为：140911、150212、150622）。

1.2方法

1.2.1方法学验证

1.2.1.1色谱条件 色谱柱：ZorbaxExtendC18不锈钢柱（250 mm×4 mm，5 μm），流动相：水-甲醇-冰醋酸（90∶10∶0.1），检测波长：252nm，进样量10 μl，1.0 mL/min流速，柱温为室温（25℃）。

1.2.1.2溶液的制备

1.2.1.2.1供试品溶液的制备 精密称取0.3 g阿昔洛韦凝胶，加入流动相25 ml稀释，充分混匀后，于3000 r/min，离心5 min，取上清液，0.2 um微孔滤膜过滤，取续滤液做供试液。

1.2.1.2.2对照溶液的制备 精密量取阿昔洛韦对照品15 mg，置于100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。

1.2.1.3系统适用性试验

1.2.1.3.1空白对照结果 试验中的空白溶剂选择为流动相，取流动相适量，除不加样品外其余操作同“1.2.1.2.1”制备空白对照，取10 ul进液相252 nm扫描，未见任何杂质峰，对测定不会造成影响，可考虑作为空白溶剂。

1.2.1.3.2精密度试验 精密量取20 μL对照品溶液，重复进样6次，分别测定峰面积，并计算其相对标准偏差RSD=1.2%（

1.2.1.3.3重复性试验 精密称取同批号阿昔洛韦凝胶6份，根据供试品“1.2.1.2.1”项操作制备溶液，取10 μL溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，可得到6份供试品溶液的相对标准偏差RSD=0.9%（

1.2.1.3.4稳定性试验 取供试品溶液与对照品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h精密量取10 μL注入液相色谱仪，进样测定，对照品溶液峰面积的RSD为1.16%（

1.2.1.3.5回收率考察 分别精密称取约10 mg同一批次的阿昔洛韦凝胶，保存至3个锥形瓶内，依次加阿昔洛韦对照品2.23 mg、5.17和10.31 mg，根据制作“1.2.1.2.1”项步骤，取续滤液10 ul进针，对峰面积进行测定，分别计算回收率为101.23%、101.18%和99.79%，平均回收率为100.67%，RSD为1.32%，与药典标准相符。

1.2.1.4线性关系考察 精密称取阿昔洛韦对照品13.4 mg置于100 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取0.05 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.80 ml、1 ml、2 ml、5 ml、6 ml置于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得系列标准溶液，分别取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，并以峰面积对其浓度进行线性回归，得线性方程为：Y=633417X-52341，（r=0.9996），结果表明，阿昔洛韦浓度在0.12～1.44 ug/mL范围内与峰面积线性关系良好。

1.2.2样品中阿昔洛韦含量测定 在同一色谱条件下分别测定阿昔洛韦对照品溶液与3批阿昔洛韦凝胶供试品溶液（取供试品0.2 g），采用峰面积归一化法和自身对照法（不加校正因子），对供试品内含有的阿昔洛韦含量进行测定。

2 结果

结果显示，通过上述色谱条件测定阿昔洛韦凝胶中阿昔洛韦含量，与标识量比较结果显示，三个批次的样本含量分别为101.23%、100.49%、100.37%，RSD

3 讨论

阿昔洛韦（C8H11N5O3）属嘌呤类抗病毒药物[3]，本文首先通过对其进行全波段扫描，确定252 nm作为其检测波长，因此时吸收最大；前期试验及文献调查显示，凝胶中存在大分子物质，可能导致色谱柱堵塞，进而影响测定，经试验分析在酸性流动相处理后，对应高聚物配合离心可有效去除，故考虑先对样品稀释后离心，排除干扰；在色谱条件选择上，本文参考了早期[4]的文献报道，结合本实验室条件优选所得。

经方法学考察可知，本次实验所选方法准确性高、精密度好、重现性和相关性均符合相关要求，且比较自身对照法和面积归一化法，发现两组结果基本一致，提示二者均可用于其含量计算。

参考文献：

[1]胡汉昆，吴东方，刘薇芝.高效液相色谱法测定阿昔洛韦眼凝胶中阿昔洛韦的含量[J].HeraldofMedicine，2010，29（12）：1644-1645.

[2]谢爱丽，王维.HPLC法测定阿昔洛韦乳膏（Ⅱ）中阿昔洛韦的含量[J].海峡药学，2013，25（4）：41-42.

凝胶色谱篇6

关键词：硝苯地平;智能水凝胶;质量标准;研究

硝苯地平智能胶的主要成分是硝苯地平，载体材料是高分子材料，制备方法为离子胶凝化法，这种一种智能药物，其对PH十分敏感。采用高效液相色谱法对于质量标准进行研究，这种方法可以有效的测定该药物中硝苯地平的含量，但是测定时，需要考虑高分子材料的干扰因素，尽量避免干扰，同时还需要注意避光，否则硝苯地平会逐渐的分解，难以实现质量控制效果[1]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪，由美国安捷伦公司生产;ODS-90TS（4.8mm×140mm，5m）色谱柱，G1315B二泵，G2170B色谱工作站和7730进样阀。HPD-44真空泵，天津市恒奥科技发展有限公司;F7超声波清洗仪（上海超声波仪器厂）。吉尼斯系列电子分析天平（德国塞多利斯仪器系统有限公司），78-5磁力加热搅拌器 （江苏省金坛市正基仪器有限公司）。

1.2 试药

苯地平智能水凝胶（哈尔滨医科大学，批号：20150118，20150119，2015

0120），硝苯地平精致品（自制，纯度99.7%），N-琥珀酰壳聚糖（中国研究院化学物理研究所，相对分子质量300000，脱乙酰度65%），海藻酸钠（浙江化学试剂站分装厂，批号041207），氯化钙（天津科密欧化学试剂有限公司，批号20140224）。

2 方法与结果

2.1 硝苯地平智能水凝胶的制备

精密称取N-琥珀酰壳聚糖和海藻酸钠适量，加入蒸馏水中，加热搅拌至完全溶解，得浓度为2%的水溶液。精密称取硝苯地平适量（药载比为1：4），加入上述水溶液中，搅拌至硝苯地平完全分散均匀，然后将上述混悬液通过5ml注射器针头（针头内径4.5mm）以1.2ml/min的速度滴加到轻度搅拌的CaCl2～2H2O溶液中交联30min，滴距5cm，反应完毕后过滤小球，水洗，室温放置自然干燥，得载药的N-琥珀酰壳聚糖一海藻酸钙凝胶小球[4]。

2.2 质量控制

2.2.1 紫外吸收。取含量测定项下的溶液，加等量的无水乙醇稀释后。照紫外一可见分光光度法测定，在237nm波长处有最大吸收，在320-355nm的波长处有较大的宽幅吸收。

图1 紫外光谱图

2.2.2 含量测定

（1）色谱条件：色谱柱：ODS-90TS（4.8mm×140mm，5m）;流动相：l%冰醋酸（三乙胺调pH至3-31）-甲醇（30：70，V/V）;流速：0.8ml/min;检测波长：237nm;进样量：20ml;柱温：35℃;保留时间：5min，分离度1.5。（2）对照品溶液的制备：避光，精密称取硝苯地平精制品6.94mg，置50m1棕色量瓶中。加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。（3）供试品溶液的制备：避光，取本品研细的粉末27mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入pH7.34的枸橼酸盐缓冲液（0.4%吐温-80）50ml，密塞，称定质量，超声处理20min，放冷，再称定质量，加枸橼酸盐缓冲液补足减失的质量，摇匀。转入分液漏斗中，用氯仿萃取3次（20、20、10m1），合并氯仿提取液，转移至50ml棕色量瓶中。加氯仿至刻度，摇匀，精密量取5ml氯仿液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移置25ml棕色量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用0.22m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[5]。（4）干扰试验：精密量取对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各20ml，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。从实验中可见在与对照色谱相应的位置上，空白对照溶液在与硝苯地平色谱峰的位置上无干扰。（5）线性关系考察：精密吸取硝苯地平对照品贮备液0.2、1、2、3、5、6、8ml置10ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成系列浓度溶液，在上述色谱条件下进样测定。以峰面积（A）为纵坐标y，浓度（c）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=69.5742505X-12.949778。r=0.9999。结果表明，硝苯地平在2.776-111.04μg/ml浓度范围内峰面积与浓度均呈良好线性关系。（6）精密度试验：取同一浓度硝苯地平对照品溶液，分别与1d内和4d内按供试品测定项下操作。测得硝苯地平日内RSD为0.73%（n=6），日间RSD为2.10%（n=6），表明仪器精密度良好。（7）加样回收率试验：取已知含量的供试品6份，每份约25mg，精密称定，按高、中、低剂量分别精密加入硝苯地平精制品，混匀，按供试品测定项下方法操作，测定其峰面积，按外标法计算。结果如表1。

表1 加样回收率试验结果

3 讨论

主要选择使用了三种流动相：（1）甲醇与水，比例为60：40;（2）甲醇与1%的冰醋酸，分别为60：40，70：30;3、1%冰醋酸与甲醇，比例为60：40;65：35;70：30，在使用前两种流动相时，发现其形成的品峰形效果不佳，存在着比较拖尾的现象，最终选择使用第三种流动相，其比例为70：30，这一比例不仅能够使阳平形成效果比较好的峰形，而且干扰条件比较少，能够达到彻底的分离。智能水凝胶的制备载体主要是高分子材料，在对此进行制备时，需要对样品进行前期处理，而且处理时还需要考虑高分子材料自身对样品含量会产生相应的影响。另外，高分子材料与样品中的药物主要是以氢键的形式而存在，必须破坏这种氢键，否则药物难以以要求的形式存在，而影响研究效果。本研究中所使用的枸橼酸盐缓冲液，以此来实现复合物的分离的目的。硝苯地平对光敏感，需避光。本文方法所得到的结果准确度高，操作简单，此外，重现性好，能够达到预期的回收效果，可以用来控制硝苯地平智能水凝胶的质量。

参考文献

[1]廖列文，龚涛，周静，周新华，崔英德.DMAEMA系列智能水凝胶的研究进展[J].化工进展，2011（2）.

[2]陈旭日，陈学刚.新型P（NIPAAm-co-IA）pH敏感智能水凝胶的合成与性能研究[J].化学推进剂与高分子材料，2011（2）.

[3]侯红瑞，张平泰.智能水凝胶在给药系统中的应用[J].价值工程，2011（15）.

凝胶色谱篇7

【摘要】

目的： 应用蛋白质组学方法筛选子痫前期差异蛋白，探讨差异蛋白与子痫前期发生的可能关系. 方法： 收集5例正常足月妊娠妇女和5例足月子痫前期重度患者胎盘母面及宫壁上的蜕膜组织，提取总蛋白. 双向凝胶电泳技术对总蛋白进行分离，考马斯亮兰染色，获得蛋白质图谱. 用 PDQuest软件进行图像分析，寻找差异蛋白，随机选取8个差异蛋白质点进行胶内酶解，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）技术获得肽质量指纹谱，搜寻蛋白质数据库鉴定蛋白质并进行初步分析. 结果： 获得了正常妊娠及子痫前期重度患者蜕膜组织双向电泳凝胶图谱，蛋白质点子痫前期组为（436±13）个点，正常妊娠组为（425±16）个点，图像分析结果显示表达丰度相差2倍以上的差异蛋白质点有14 个，它们在子痫前期中均表现下调. 随机选取的8个蛋白质点均成功得到鉴定，它们分别是膜联蛋白Ⅴ，血红蛋白β链，RhoGDP解离抑制剂1，氯离子细胞内通道蛋白1，原肌球蛋白4，平滑肌蛋白22α2，α1抗胰蛋白酶和纤维蛋白原β链. 结论： 子痫前期重度患者蜕膜组织中存在差异蛋白，这些蛋白质在子痫前期的发病过程可能起重要作用.

【关键词】 先兆子痫；蜕膜；蛋白质组学；电泳，凝胶，双向

【Abstract】　AIM: To screen the differential proteins in deciduas of preeclampsia and to study their roles in preeclampsia. METHODS: The deciduas from 5 normal women of fullterm pregnancy and 5 preeclampsia patients were collected to obtain the total proteins.The proteins from the 2 groups underwent twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE) and Coomassie brilliant blue stained gel imaging with PDQuest image analysis software. The peptide mass fingerprinting(PMF) was acquired by matrix assisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS) .The resulted data were then searched against protein databases for the identification of the proteins， and an initial analysis was made accordingly. RESULTS: 2DE patterns of the deciduas of normal fullterm pregnancy group and preeclampsia group were acquired.According to them， (436±13) protein spots were seen in preeclampsia group and( 425±16) in normal pregnancy group.Fourteen differential spots were downregulated in preeclampsia group among them and 8 differential spots were all successfully identified.They were Annexin Ⅴ， Hemoglobin β chain， RhoGDPdissociation inhibitor 1， chloride intracellular channel protein 1，Tropomyosin α4 chain， Transgelin 22α2， α1antitrypsin and Fibrinogen β chain， respectively. CONCLUSION: Differential proteins found in deciduas from patients with severe preeclampsia might play an important role in the pathogenic process of preeclampsia.

【Keywords】 preeclampsia; decidua; proteomics; electrophoresis， gel， twodimensional

0引言

子痫前期（preeclampsia，PE）是一种人类妊娠期间特有的原因不明的多系统疾病，严重危害母婴健康［1］. 蛋白质组学是近年来兴起的一门新学科，因具有高通量的特点而广泛应用于临床. 子痫前期的蛋白质组学研究主要集中在寻找早期特异性蛋白质标志物和发病机制的探讨［2-3］，并运用蛋白质组学技术对子痫前期患者的外周血、脑脊液、羊水和胎盘滋养细胞等进行了各种研究［4］. 但目前子痫前期仍然没有理想的标志物，具体的发病机制仍未阐明. 本实验利用蛋白质组学技术，通过比较子痫前期重度患者和正常妊娠妇女蜕膜的蛋白表达差异，探讨引起子痫前期发生的可能因素，为研究子痫前期的病因和寻找特异性标志蛋白提供依据.

1对象和方法

1．1对象选择 200609/200704在中南大学湘雅第三附属医院产科住院的足月子痫前期重度患者5例（ 诊断及分类参照全国统编教材《妇产科学》第 6 版）为子痫前期组；正常足月妊娠患者5例（无内外科合并症，因臀位和头盆不称）为正常妊娠组. 子痫前期组与正常妊娠组年龄分别为23～34（30.56±3.26）岁和24～31（27.22±2.89）岁，差异无统计学意义（P＞0.05）；分娩孕周分别为35+6～39+2（37.86±2.02） wk和37+2～39+6（38.35±1.89） wk，差异无统计学意义（P＞0.05）. 两组患者分娩方式均为硬膜外麻醉下剖宫产. 在胎盘娩出后即刮取胎盘母面及宫壁上的蜕膜组织，用冰无菌生理盐水冲洗，去除血液及黏液成份并吸干水份，取新鲜蜕膜组织5 g，液氮保存备用. 另取部分蜕膜组织用40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋备HE染色用. 术前静脉抽血3 mL，3000 r/min，离心15 min，取上清液保存备用.

丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠（SDS），四甲基乙二胺（TEMED），过硫酸铵（AP），丙基硫酸盐，三羟甲基氨基甲烷等（美国SigmaAldrich 公司）；胰蛋白酶（美国 Promega 公司）；低温高速离心机（Hettich公司，16R型）；VoyayerDE STR 4307 MALDITOFMS质谱仪（Applied Biosystem 公司）；固相pH胶条（pH 3～10，24 cm），2D Quant Kit蛋白定量试剂盒和双向电泳系统（IPGphor等电聚焦仪，Ettan DALT垂直电泳槽，Imagescanner 图像扫描仪，图像分析软件 PDQuest）为瑞典Amersham Biosciences公司产品.

1．2方法

1.2.1蛋白样品的制备收取的冻存蜕膜组织，经过裂解液裂解、研磨、离心取上清液提取蜕膜组织总蛋白，分装，-70℃保存. 按2D Quant Kit蛋白定量试剂盒操作步骤测蛋白质浓度.

1.2.2双向凝胶电泳第一向固向IPG胶条等电聚焦 ，1000 μg总蛋白质与水化上样缓冲液混合，总体积 450 μL，加入IPG胶槽中，24 cm IPG固向胶条，线性，pH 3～10，IPG phor水平电泳仪电泳. 等点聚焦条件设置： ① 30 V，20℃水化 14 h； ② 500 V/h； ③ 快速升压 1000 V/h， 除盐； ④ 线性升压 8000 V/8.5 h等电聚焦. 胶条在平衡液A液与B液各平衡15 min后胶条移至分离胶上进行第二向电泳即SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳. 电泳条件如下：恒压，2.5 w/胶，30 min，然后以11 w/胶恒功率电泳， 直至溴酚蓝前沿迁移至凝胶底边停止电泳. 第二向电泳时间约需6 h左右.

1.2.3考马斯亮蓝染色取出电泳后的凝胶，双蒸水清洗后用考马斯亮蓝G250的染色方法进行显色. 染色固定过夜，双蒸水清洗脱色直至背景清晰.

1.2.4图像采集与分析考马斯亮蓝染色后的凝胶通过ImageScanner扫描仪以及LabScan扫描仪控制软件进行图像扫描以获取二维凝胶的电子图像. 运用图像分析软件PDQuest 7.0进行分析， 包括蛋白质点的检测，背景消减，标准化，匹配，建立平均凝胶，比较差异等分析以确立差异表达的蛋白质.

1.2.5蛋白质酶解经过图像分析，随机选取丰度差异表达相差2倍以上的14个点中的8个点做质谱鉴定. 用人工方法切胶，洗胶，脱色，脱水，原位酶解. 然后进行样品萃取，点样.

1.2.6MALDITOFMS质谱分析将制备好的点样板放入VoyagerDE STR 4307 MALDITOFMS质谱仪中进行分析，获得肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting， PMF）.

1.2.7数据库查询MALDITOFMS质谱图解谱采Mascot Wizard软件进行 ，Mascot Wizard软件均采用其默认参数设置. 其查询网址为：matrixscience.com/cgi/searchform.pl?FORMVER=2＆SEARCH=PMF. 在NCBInr，Swissprot蛋白数据库中搜索理论上酶解肽段能与之相匹配的蛋白，结合蛋白质在胶上的等电点和分子量鉴定蛋白质. Mascot分数＞55分则认为得到鉴定，否则视为未得到鉴定.

统计学处理： 采用SPSS 13.0 统计软件进行分析，数据结果以x±s表示，进行t检验，以α=0.05（双尾）为检验水准，P

2结果

2．1蜕膜组织的HE染色经HE染色证实，实验所取子痫前期组与正常妊娠组胎盘母面组织均为蜕膜组织. 大部分典型多边形蜕膜细胞，呈铺砖状排列，未见绒毛（图1）.

图1蜕膜组织HE ×400

2．2蜕膜组织总蛋白质双向电泳图谱 两组蜕膜组织总蛋白在相同条件下进行双向凝胶电泳分离，并重复3次. 图像扫描后，得到重复性好的两组蜕膜组织的双向电泳图谱 （ 图 2）. 子痫前期组图谱检测到（ 436±13）个点， 平均匹配率为79.2%. 正常妊娠组图谱检测到（425±16）个点，平均匹配率为78.6%. 蛋白点主要集中在Mr = 13～80 ku，pH=3～8范围.

A：正常妊娠组蜕膜组织； B：子痫前期组蜕膜组织.

图2蜕膜组织考马斯亮蓝染色图谱

2.3差异蛋白质点的质谱鉴定PDQuest 软件进行图像分析发现，选取丰度差异表达相差2倍以上的蛋白质点有14个，在子痫前期组表达均下调. 随机选择8个差异表达的蛋白质斑点均成功得到鉴定. 图3为子痫前期组和正常妊娠组部分显著差异蛋白点的局部放大图. 黑箭头所指为已鉴定的部分显著差异蛋白质点，其数字代表相应的蛋白质点号. 用Mascot软件搜索蛋白数据库，获得对应的蛋白质(表1).

A：正常妊娠组蜕膜组织；B：子痫前期组蜕膜组织.

图3蜕膜组织部分显著差异蛋白点的局部放大图

3讨论

人体蜕膜组织是母胎界面的重要组成部分，与胎儿滋养层直接接触，具有参与母胎免疫耐受形成及维持妊娠的功能. 在吕英璞等［5］的研究中发现子痫前表1蛋白质点肽质量指纹图谱检索SWISSPROT数据库结果期患者蜕膜组织中Th1/Th2比率明显高于外周血，母胎界面的局部免疫失调，尤其是Th1细胞的过度表达是子痫前期发病的关键环节之一. 本研究选取分娩后的蜕膜组织，能够直接反应该疾病母胎界面存在的蛋白分子变化.

在本研究中，膜联蛋白Ⅴ在子痫前期组中表达明显下调. 膜联蛋白Ⅴ是一种胎盘内抗凝蛋白，对暴露于活化血小板表面的磷脂酰丝氨酸具有高亲和性. 在体内，磷脂酰丝氨酸存在于活化血小板或活化内皮细胞的质膜外层，为凝血因子提供一个聚集进而促发凝集的表面. Tait 等［6］在兔和猪血栓模型中都发现了膜联蛋白Ⅴ的抗凝作用具有血小板指引靶向性. 膜联蛋白Ⅴ这种抗凝蛋白不足很可能是造成子痫前期患者的高凝状态的原因之一. α1抗胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可通过对各种蛋白酶的抑制作用，保护组织免受蛋白酶破坏，从而维持机体内环境稳定. 凝血酶也是一种以丝氨酸为活动中心的蛋白酶. 本研究中发现α1抗胰蛋白酶在子痫前期组中表达下调. 由此我们推测由于α1抗胰蛋白酶这种凝血酶抑制剂分泌不足导致凝血酶增高从而参与了子痫前期患者高凝状态的发生发展. RhoA属于Rho家族蛋白的Rho亚家族成员，是重要的细胞内信号分子. 它能结合并水解鸟苷酸，结合GTP为活性型，结合GDP为失活型. 有研究［7］表明RhoA可能通过调节滋养细胞浸润、低氧反应及血管舒缩功能等参了与子痫前期的发病. 本研究发现RhoGDP解离抑制剂1在子痫前期中表达下调，相应解离的RhoA将增加，活性RhoA就应在子痫前期中高表达，这与其他研究结果理论上是一致的. 纤维蛋白原β链是由肝合成和分泌的一种糖蛋白，其转录被认为是整个纤维蛋白原分子表达的限速步骤， FgBβ基因多态性单独或与环境因素作用使循环中的血浆纤维蛋白原水平升高，在调节血浆纤维蛋白原水平方面起重要作用［8］ . 本研究结果显示这些蛋白在子痫前期组表达均下调，它们在子痫前期中的作用以及本实验中的2DE图谱蛋白质点并不是很多，如对样品采用预分级和亚蛋白质组重叠技术有助于低丰度等功能蛋白的检出等问题还有待我们进一步探讨.

【参考文献】

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［6］Tait J F， Cerqueira MD， Dewhurst TA， et al. Evaluation of annexin Ⅴas a plateletdirected thrombus targeting agent［J］ . Thromb Res ，1994，75:491-501.

凝胶色谱篇8

【摘要】

目的为开展针灸治疗胃溃疡的蛋白质组研究，建立并优化其蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术，提高其分辨率及重复性。方法对醋酸型胃溃疡大鼠进行针刺后取其胃部溃疡处组织，对组织蛋白质的提取方法进行改进，优化双向凝胶电泳的关键因素与环节，如样品的制备及预处理，第一向IPG等电聚焦的上样量及电泳参数，第二向垂直平板SDS凝胶浓度、染色方法等。利用PDQuest7.1软件分析获得的二维凝胶图像。结果以固相pH梯度-IPG胶条（pH3～10）进行第一向等电聚焦，以SDS 均一胶（12.5%）的垂直电泳为第二向，成功地得到了两组大鼠胃组织斑点分布均匀、数目较多的双向凝胶电泳图谱。结论通过对蛋白质双向凝胶电泳技术的建立及优化，获得了适合于研究胃溃疡高分辨率、高重复性的双向凝胶电泳图谱。

【关键词】 双向凝胶电泳 蛋白质组 SDS凝胶电泳

蛋白质组学是应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门重要学科，采用蛋白质组分析应用和技术可以识别及鉴定一种细胞或组织所表达的全部蛋白质及它们的表达模式，从整体蛋白质水平上在一个更加深入、更贴近生命活动本质的层次上去探讨一些重要的生理、病理现象的本质。典型的蛋白质组研究有两个关键的步骤：①细胞或样品组织中蛋白质的分离。目前最佳的分离方法是多维色谱技术和双向凝胶电泳(two-dimensinnal electrophoresis，2-DE)。②蛋白序列的鉴定。常用质谱仪鉴别出多维色谱和2-DE等分离出的差异蛋白是一已知蛋白，还是一新蛋白［1～3］。2-DE建立于1975年，三十余年的应用和发展使其技术渐于成熟，故在多维色谱出现后，2-DE仍被广泛采用，它是蛋白质组研究的基础，亦是当代研究的关键技术。

胃溃疡是一种世界性的常见病，人群中患病率高达5%～10%，亦有报告推测，每5名男人和10名女人中，可能有一人在他们的一生中患过本病，本病严重地危害了人们的健康［1］。针灸治疗本病取得了较好的疗效，并具有简便、经济、安全、并发症发生率低和不易复发等优势，但目前对于针灸治疗胃溃疡的疗效机制尚不清楚。运用蛋白质组学思维，以2-DE为技术手段研究针刺对醋酸型胃溃疡大鼠胃组织匀浆蛋白的影响，将有助于全面、真实地揭示胃溃疡发生的病理过程以及针刺治疗本病的效应机理。

1 材料与仪器

1.1 动物

Wistar大鼠60只（长春高新医学动物实验中心），雄性，清洁级，体质量（200±30）g。

1.2 仪器

电动玻璃匀浆机、低温超速离心机、电子天平、P20、P100、P1000型精密移液器、MP3 多功能微型垂直板电泳系统(Bio-Rad)、PROTEAN II xi Cell垂直板电泳系统(Bio-Rad)、Power Pac 200和1000电源(Bio-Rad)、GS-800光密度扫描仪(Bio-Rad)、IEF/SDS-PAGE图像分析软件PD Quest 7.3.1(Bio-Rad)、SZ-93型自动双重纯水蒸馏器、TY-B型多用脱色摇床。

1.3 试剂

17cm IPG3-10预制胶条、尿素、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(Iodoacetamide)、丙乙酰胺（Acr， A.R.）、N，N甲叉双丙乙酰胺（Bis，A.R.）、40%载体两性电解质(Bio-Lyte 3/10 ampholytes)、矿物油(Minal Oil)以上试剂均来自美国Bio-Rad；两性去垢剂CHAPS、四甲基乙二胺（TEMED， A.R.）、过硫酸胺（APS， A.R.）、十二烷基硫酸钠（SDS， A.R.）以上试剂均来自AMRESCO；低溶点琼脂糖(Agarose， Promega)、三羟甲基氨基甲烷（Tris， A.R.， BM）、氨基乙酸（Glycine， A.R.， BM）、丙三醇(Glycerin， A.R.， 上海化学试剂有限公司)、考马斯亮蓝R-250(CBB， R-250， A.R.， 上海化学试剂有限公司)、盐酸(HCl， G.R.，上海)、硝酸银(AgNO3， A.R.， 上海) 、无水碳酸钠(Na2CO3， A.R.， 上海) 、硫代硫酸钠(Na2S2O3， A.R.， 上海化学试剂有限公司)、牛血清白蛋白标准品(BSA， 上海)、苯甲基磺酰氟(PMSF， 上海)。

2 方法

2.1 设计将60只大鼠随机分为3组：正常对照组、模型组、针刺治疗组。采取乙酸涂抹法造模，术后24 h开始正常喂养，针刺治疗组对足三里、中脘进行毫针针刺，10 d为1个疗程。10 d后取3组胃组织进行观察与研究。

2.2 样品处理胃组织总蛋白的提取：于溃疡模型成功后处死大鼠，分别取出正常对照组与模型组观察溃疡形成情况，取针刺治疗组大鼠胃溃疡处组织进行处理，予冰盐水反复清洗干净，以去除血液， 并尽可能剪去多余的其他组织，滤纸吸去多余的液体，立即置液氮中速冻，后移至-80 ℃低温冰箱保存。将已处理过的标本从-80 ℃冰箱中取出，称取针刺治疗组大鼠胃组织。分别采取传统方法及改良方法，下面仅介绍改良方法，在讨论部分介绍二者区别。剪取约200 mg组织，加入2.0 ml细胞裂解液（8 mol/L的尿素，4%的CHAPS，100 mmol/L的DTT，40 mmol/L的Tris-base和0.5%的两性电解质），在冰水混合物中以1 500 r/min仔细制备匀浆，反复冻融3个循环，加入20 μg/ml DNase I 10 μl和5 μg/ml RNase A 10 μl，在冰浴中1 500 r/min匀浆10 min。转移至离心管，4℃作用15 min后，以15 000 r/min离心30 min，收集上清液即为蛋白质粗提物，-80℃冷冻保存待用。

2.3 样品浓度测定Bradford法［4］。

2.4 双向电泳

2.4.1 第一向固相pH梯度(IPG)等电聚焦参照Gorg A等［5］的方法略有改动。取上述蛋白质样品，按1 mg的上样量计算出蛋白质上样体积，依该体积加入蛋白质样品，加入样品缓冲液至终体积300 μl，在液体涡旋仪及手掌型离心机上分别混匀。取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17 cm pH 3～10），室温中放置10 min。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。将样本均匀加入胶槽中，胶面向下放入17 cm IPG干胶条，胶条的正极对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，避免气泡产生，然后滴加覆盖矿物油3ml，需缓慢地一滴一滴将矿物油加在胶条的塑料支撑膜上。对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置程序。自动程序电泳参数设置见表1。表1 等电聚焦的程序（略）

2.4.2 平衡等电聚焦后迅速取出IPG 胶条，在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。将胶条胶面朝上转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，并加入10 ml平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上平衡15 min。第1次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用润湿的滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，将胶条胶面朝上转移至加有平衡缓冲液II的溶涨盘中， 继续在水平摇床上缓慢摇晃15 min。第2次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用润湿的滤纸吸取多余的平衡液。将IPG胶条从样品水化盘中移出，并完全浸末在1×电泳缓冲液中。

2.4.3 第二向垂直SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳配制12.5％的均匀SDS聚丙烯酰胺凝胶。用滤纸吸去SDS聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解(中火1 min左右)。将IPG胶条从1×电泳缓冲液中移出，胶条一端放上低分子量蛋白标记10 μl，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。用镊子轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触，避免在胶条下方产生气泡。而后在IPG胶条上注入加热溶解好的低熔点琼脂糖，待低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。电泳参数：初始电压80 V约5 min，以后200 V直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止。

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2.4.4 考染显色将凝胶从玻璃板上剥离下来，放置在干净的染色盘中。采用Bio-Safe Coomassie stain染色法。考染步骤如下：将凝胶浸于去离子水中，摇床上漂洗2次，10 min/次；加入适量Bio-Safe考马斯亮蓝R-250以使凝胶完全浸没，摇床上1 h或过夜。最后将胶浸入去离子水中，摇床上脱色至底色脱去。

2.4.5 凝胶图象采集与分析应用GS800扫描仪器采集凝胶图象，用PDQuest二维分析软件对电泳图谱进行分析。

3 结果

3.1 针灸治疗组胃组织蛋白质的提取率和上样量 样品蛋白质浓度在5～5.5 g/L。双向电泳的上样量在185～195 μl。

3.2 针灸治疗组胃组织蛋白质2-DE的分辨率和重复性 平均含（350±50）个蛋白点，匹配率85.56％。

3.3 实验改进图片

选择宽pH 范围(pH 3～10)的固相线性17 cm 干胶条和12.5%的均匀SDS聚丙烯酰胺凝胶， 采用初始80V电压5 min，然后以200 V恒压电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处停止电泳，可以得到斑点分布均匀、数目较多的双向凝胶电泳图谱。如图1 和2所示。

4 讨论

近年来对于胃溃疡的发病机制的研究取得了一定的进展，发现了许多与疾病发生、发展有关的因素及分子调控机制，尤其是基因组学的研究有了很大进展，但影响疾病发生、发展的重要机制是蛋白质分子种类和功能状态的改变。蛋白质组的研究可能为这些疾病发病机制的研究开辟一条新的道路，该方法改变了以往研究只能针对一种或一类蛋白质的限制，使研究机体复杂多变的蛋白质群体成为可能。特别是在研究针灸治疗疾病的机制方面，蛋白质组学的思路与中医的整体观念有着相似的观点。2-DE技术是蛋白质组研究的核心技术，该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质粗提物，构建特定组织或细胞的蛋白质“二维参考图谱”，分析特定时间与生理状态下蛋白质的表达情况，进行蛋白质组差异比较。通过这种差异的比较，可以为我们提供进一步的研究线索，从整体水平把握研究方向。

建立针灸治疗胃溃疡组织蛋白组学效应研究平台，为探索针灸疗效机制提供了新方法、新技术和新模式。对已有平台进行优化必将极大地加速研究进程，尽早地获得研究成果，有利于针灸理论发展和临床应用。

4.1 样品制备从组织中提取蛋白质的影响因素很多，寻找理想的方法尽可能完全地抽提细胞和组织中全部蛋白质一直是双向凝胶电泳标本预处理研究的热点和难点。本法将组织置于冰盐水中清洗干净，立即置-80℃冰箱中速冻保存，可以去除黏膜表面杂质、黏液和血细胞，保持蛋白的完整性，最大程度地减少蛋白降解和丢失。由于不同组织中疏水性蛋白质、亲水性蛋白质、低丰度蛋白质、高丰度蛋白质和极端等电点蛋白质同时存在，很难用单一抽提液和方法将不同组织细胞中的蛋白质完全制备出来。为提高组织蛋白质的溶解性，提高蛋白质的提取浓度，我们主要注意了两个环节：一是样品裂解液的选择；二是充分的组织匀浆、超高速离心。样品裂解液中较高浓度的尿素(8 mol／L)能破坏氢键，溶解并使蛋白质变性、解折叠。DTT通过断裂半胱氨酸的二硫键，打开蛋白质分子内键，从而促进蛋白质溶解。CHAPS在含有尿素的溶液中具有较好的水溶性，促进疏水性蛋白质的溶解。为去除其他干扰蛋白质溶解的物质，如核酸、脂肪酸和盐离子，尤其是核酸，与蛋白质结合后，会产生人工假象和条纹，所以在裂解液中加入微量的DNA酶和RNA酶，以减少干扰，消减背景。充分的组织匀浆、超速离心等都是利用机械力来对蛋白分子解聚。超速离心被用来去除溶液中干扰蛋白溶解的其它物质。通过上述步骤，可以提取出组织的绝大多数蛋白成分。

4.2 上样量选择提高上样量有利于低丰度蛋白质的检测。但上样量过高，高丰度蛋白质的斑点过大会影响其他蛋白质点的分离和分析，而且样本量过高，其在重泡胀液体系中所占体积过大，可能导致重泡胀不充分，影响IPG等电聚焦的效果。因此在样品处理后，选择合适的上样量对获得高质量的2-DE图谱尤为重要。我们研究发现在考马斯亮蓝染色的2-DE体系中上样量在lmg，可以得到较理想的2-DE图象。

4.3 固相pH梯度等电聚焦选择宽pH范围(pH 3～10)的固相化线性17 cm干胶条。IPG等电聚焦时初始电压缓慢递增，容易使样品进入凝胶，即使是不易分离的蛋白质分子在低电压持续作用下也能向其等电点缓慢移动。因此采用了初始电压为250 V，且逐渐递增至10 000 V的聚焦程序，从而使聚焦完全。

4.4 第二向垂直的SDS-PAGE电泳参数设置为80v约5 min，然后以200 V恒压电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底部停止电泳。对于分离胶的浓度，选择了12.5%，结果斑点分布均匀，数目较多。

4.5 蛋白质染色2-DE不同的染色方法对样本量的要求不同。传统的考马斯亮蓝染色技术由于其较低的成本、使用方便和与下游的蛋白质鉴定技术的良好相容性得到了非常广泛的使用，但其对样本量的要求较高，通常1 mg左右的上样量才能检测到100 ng级的蛋白质［6，7］。银染技术比考染灵敏度高，可检测到1 ng级的蛋白质。但银染步骤非常繁杂，胶与胶之间的重复性较差，有文献报告其差异可达20％［8］，而且银染由于需要加入醛类作为固定剂，所以干扰质谱分析的结果［9］，与蛋白质鉴定技术的相容性还有待改进。因而我们的实验体系选择Bio-Safe Coomassie stain染色法，它具有操作简单、省时、重复性较好、可检测到ng级的蛋白量等优势，便于为今后的工作提供有利条件。

双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一，探索将其用于针灸治病机理的研究是时展的需要，更是中医药发展的需要。虽然我们采取了一系列措施来对针灸治疗胃溃疡蛋白质组学效应研究平台进行技术优化与策略分析，但在双向凝胶电泳图谱中仍依稀可见许多水平条文，故今后的重点是如何提高双向凝胶电泳的分辨率和重复性，以便开展大规模分析。我们的研究也尚处于初试阶段，优化技术平台只是基础工作，最终目的在于通过高分辨率和高重复性的双向电泳图谱进行差异蛋白的筛选和鉴定，以此为针灸治疗胃溃疡的机理研究提供理论依据和技术支撑。

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凝胶色谱篇9

【关键词】

甲磺酸帕珠沙星;眼用即型凝胶;制备;质量控制

Preparation and quality control of the pazufloxacin mesilte in situ forming of eye gel

JIANG Fang-ning,LIU Xiao-shuan,LIU Guang-bin.Jiugang Hospital of Jiayuguan City,Gansu Jiayuguan,735100,China

【Abstract】 Objective To establish a method for preparation and measuring the content of the pazufloxaxin mesilate in situ forming of eye gel.Methods In this study,the pazufloxacin mesilate in situ forming of eye gel took sodium chloride as buffer to regulate the pH and osmotic pressure.The sustained-release eye gel using sodium alginate as base material was studied.The ultraviolet spectrophtonetric method was established for the determination of pazufloxacin mesilate.Results There was a good linear relationship within the concentration range of 6.02~60.2 μg/ml.r=0.99999.The average recovery of pazufloxacin mesilate was 101.85%.The RSD was 1.95%.The osmotic pressure and pH of the solution were 280 m0sm/kg and 5.0~7.0 respectively.The result of rabbit-eye irritation test showed that the eye drops had no irritation.Conclusion The pazufloxacin mesilate in situ forming of eye gel is promising with simple formula,preparation process,easy quality and stability.

【Key words】

Pazufloxacin mesilate;In situ forming eye gel;Preparation;Quality control

甲磺酸帕珠沙星(Pazufloxacin mesilate)是新一代喹诺酮类抗菌药物,抗菌谱广,对革兰阳性、阴性菌均有效。其对多种感染症均有较高疗效,尤其对呼吸道感染、外科手术感染如胆道感染、尿路感染和眼内感染疗效更佳,而在中枢神经系统方面的不良反应较弱,本品的不良反应发生率与注射用头孢菌素类药物大致相同[1]。现其开发的剂型有注射剂和颗粒剂,尚未见其他剂型的报道,为拓宽其使用范围,经查阅文献[2],笔者研制了甲磺酸帕珠沙星眼用即型凝胶,现将其制备及质量控制方法报告如下。

1 材料

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 LC-2010AHT型高效液相色谱仪(日本岛津),岛津LC solution色谱工作站,AUY220岛津电子分析天平;

作者单位:735100甘肃省嘉峪关市酒钢医院

PHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)。

1.1.2 试剂 甲磺酸帕珠沙星对照品(中国药品生物制品检定所,批号:130460-200701),甲磺酸帕珠沙星(药用级),海藻酸钠(药用级),氯化钠(药用级),尼泊金乙酯(药用级)。乙睛为色谱纯,水为纯化水,其他试剂为分析纯。

2 处方及制备

2.1 处方 甲磺酸帕珠沙星3 g,氯化钠6.5 g,尼泊金乙酯0.3 g,海藻酸钠10 g,注射用水加至1000 ml。

2.2 制备 称取海藻酸钠10 g,加入注射用水200 ml,在沸水浴中搅拌使溶解,静置备用,保持温度在70℃左右。称取尼泊金乙酯0.3 g加至热注射用水(70℃)500 ml中,加入氯化钠6.5 g,搅拌使全部溶解。加入制备好的海藻酸钠溶液,搅拌至澄清。精密称取甲磺酸帕珠沙星3 g加至注射用水100 ml中搅拌使溶解,再加入上液中搅拌均匀。以0.1 mol/L的NaOH溶液调pH至5.0~7.0,加注射用水至900 ml。

以0.8 μm的滤膜过滤,添加注射用水至1000 ml,摇匀,严封,用100℃流通蒸汽灭菌30 min,无菌分装即得,8 ml/支。

3 质量控制

3.1 性状 本品为淡黄色澄明液体。

3.2 鉴别

3.2.1 取样品溶液进行紫外扫描。结果本品在247nm与335 nm波长处有最大吸收。在含量测定项下,样品溶液主峰的保留时间应与甲磺酸帕珠沙星对照品溶液主峰的保留时间一致。

3.2.2 本品显有机氟化物的鉴别反应[3]。

3.3 检查 取本品检测其pH值应为5.0~7.0。其他检查应符合2005年版《中国药典》中的相关规定[3]。

3.4 含量测定

3.4.1 色谱条件 色谱柱为Inertsil ODS-SP-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙睛:磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾6.8 g、三乙胺5 ml和磷酸4 ml加水至1000 ml,pH为2.8)(20:80)[4],流速为1 ml/min,测定波长为247 nm,柱温为25℃,进样量为10 μl。主药和其他杂质峰的分离度应大于1.5,空白辅料对样品测定无干扰,样品主峰的保留时间与对照品主峰的保留时间一致,计算采用外标峰面积法,对照品、样品、空白样品的色谱图见图1。

3.4.2 对照品及供试品溶液的制备

3.4.2.1 对照品溶液 取干燥至恒重的甲磺酸帕珠沙星对照品,用流动相制成每1 ml中含约0.3 mg的溶液,作为对照品溶液。

3.4.2.2 供试品溶液及空白溶液 精密量取甲磺酸帕珠沙星原料药适量用流动相稀释成每1 ml中含有0.3 mg的溶液,作为供试品溶液。同法制备不含甲磺酸帕珠沙星的空白溶液。

3.4.3 标准曲线的制定 精密称取甲磺酸帕珠沙星对照品30 mg,用流动相溶解并稀释至100 ml,摇匀,分别精密量取2,5,8,10,15,20 ml,置于100 ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀。取10 μl注入液相色谱仪,测定峰面积,将帕珠沙星峰面积(A)有度(C)进行回归,得回归方程:A=54504.7C+3946.94(r=0.99999,n=6)。结果表明,甲磺酸帕珠沙星在3~60 μg/ml范围内线性关系良好。

3.4.4 精密度试验 取“3.4.2”项下对照品溶液,于1 d内0、2、4、6、8、10 h时对照“3.4.1”项下色谱条件分别进样。结果,其浓度为30 μg/ml,日内峰面积相对标准差RSD=0.053%;日间峰面积相对标准差RSD=1.71%。

3.4.5 重视性试验 按样品含量测定方法,测定同一批样品,结果含量平均值为98.90%(RSD=0.114%,n=6)。

3.4.6 回收率试验 按处方配制浓度分别为24,30,36 μg/ml的高、中、低3种浓度甲磺酸帕珠沙星,精密吸取各浓度1 ml,照“3.4.1”项方法操作,每个浓度平行测定3份,平均回收率101.85%,RSD为1.95%。结果见表1。

3.4.7 含量测定 取3批样品,按“3.4.2”项下样品溶液的制备方法制备,进样10 μl注入高效液相色谱仪,按“3.4.1”项下色谱条件测定峰面积,计算含量,结果见表2。

4 讨论

4.1 眼用即型凝胶依据体内外生理环境的不同而发生相的转变,滴入眼中后由体外的液体形式立即转化成凝胶。此类剂型有一定新颖性,在贮存期呈液态,滴入眼内后呈半固体状态,不仅可解决普通滴眼剂眼内滞留时间短、生物利用度不高的问题,也可克服普通眼用凝胶缺乏良好的铺展性,剂量不易控制的问题。眼用即型凝胶通常为低粘度的高分子溶液剂,其形成机制是利用高分子材料对外界刺激的响应,使高分子聚合物在生理条件下发生分散状态或构象的可逆变化,完成由溶液向凝胶的转化过程[5]。甲磺酸帕珠沙星是新型喹诺酮类广谱抗菌药物,通过抑制细菌DNA拓扑异构酶Ⅱ和Ⅳ的活性而抑制细菌DNA的合成,由于其分子结构中7位引入了氨基环丙基,不良反应比同类品种明显降低。临床用于治疗革兰阳性菌及阴性菌引起的呼吸道、泌尿生殖系统、皮肤软组织及外科感染[4]。

4.2 本研究采用高效液相色谱法测定含量,有效排除了干扰,测量结果准确,具有重现性好的特点。总之,本制备工艺简便、可行,质量控制方法操作快速,结果准确可靠。

参 考 文 献

[1] 张晶,薛爱芳,糜志远,等.紫外分光光度法测定甲磺酸帕珠沙星原料药含量.光谱实验室,2006,23(5):931.

[2] 罗云,郭咸希.盐酸左氧氟沙星眼用即型凝胶的研制.中国药师,2007,(10):1190-1192.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].2005年版.化学工业出版社,2005:附录19、58.

凝胶色谱篇10

【摘要】  目的研究双柏凝胶剂中主要成分大黄素的透皮吸收特性，并考察了处方中其他成分对大黄素吸收的影响作用。方法采用改良的franz扩散装置，以离体鼠皮为屏障、ph7.4磷酸盐缓冲液为接受介质，研究了大黄提取物凝胶及双柏凝胶剂中大黄素透皮吸收性能。结果在大黄提取物和双柏凝胶剂中，大黄素12 h累积透皮释药为10.03，37.06 μg·cm-1。结论大黄提取物凝胶中大黄素具有一定的透皮吸收，但不太理想，而双柏凝胶剂由于其他组分的加入，促进了大黄素的吸收，从一个方面佐证了该处方制成凝胶剂的可行性。

【关键词】  双柏凝胶剂； 大黄素； 透皮吸收

          双柏散由大黄、黄柏、泽兰、侧柏叶、薄荷组成，具有消肿止痛，活血化瘀之功效，主要用于治疗跌打损伤早期及疮疡初起红肿热痛等症［1］。传统的蜜调散剂使用时易污染衣物，且存在较多的过敏反应。为方便使用，同时为提高药物的生物利用度，我们将其制成双柏凝胶剂。本文以大黄提取物凝胶作对比，以大黄素为指标，考察了双柏凝胶剂透皮吸收情况，从而对双柏凝胶剂的体外吸收进行初步评价。

1  仪器与试药

1.1  仪器高效液相色谱仪（日本岛津）：lc-10atvp双泵，slc-10avp控制器，spd-10avp紫外检测器，cto-10asvp柱温箱。

1.2  试药大黄素对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号为0756-9908)；甲醇为色谱纯;大黄、黄柏、泽兰、侧柏叶、薄荷由柳州市神农中药饮片厂提供，经柳州市中医院药检室鉴定，符合《中国药典》要求；其余试剂均为分析纯。

2  方法与结果

2.1  凝胶剂的制备取处方量的大黄(a)和根据双柏散处方比例称取药材粗粉(b)，均加95%乙醇浸泡6 h，以5～7 ml/min的速度渗漉提取，相应渗漉液浓缩至约50 g，加入3 g 卡波姆940，密闭放置过夜使其充分溶胀，加蒸馏水至100 g，研匀即得。分装于密闭避光的容器中，贮存于凉处。a：大黄凝胶;b:双柏凝胶

2.2  建立测定方法

2.2.1  色谱条件

色谱柱为选kromasil- c18 柱(5μm，250 mm×4.6  mm)；流动相为甲醇-水（6:4）；流速1.0 ml/min；检测波长254 nm；柱温30℃；进样量：10 μl。

2.2.2  对照品溶液制备

精密称取大黄素对照品5 mg，加甲醇溶解定容至25 ml，制成0.2 mg/ml的溶液，即可。

2.2.3  供试品溶液制备

精密称取凝胶剂1 g，水浴浓缩至近干，加蒸馏水10 ml，浓盐酸1 ml，沸水浴中水解30 min，再加氯仿20 ml，超声振荡20 min，置分液漏斗中分层，取氯仿层；水层用氯仿洗3次，每次10 ml，合并氯仿液，挥干。加适量甲醇溶解，转移至10 ml容量瓶中，超声振荡数分钟使溶解完全，加甲醇至刻度，摇匀。针孔式微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4  线性关系

考察精密吸取对照品溶液用流动相稀释成0.4，1.0，2.0，4.0，10.0 μg·ml-1进样10 μl测定，以大黄素进样量（y）和峰面积（x）进行线性回归，求得标准曲线的回归方程为：y=3 300.3x-1 422，r=0.999 8。结果表明大黄素进样量在0.4～10 μg·ml-1范围内有良好的线性关系。

2.2.5  精密度实验

精密吸取上述对照品溶液10 μl，重复进样测定5次，结果大黄素峰面积值的rsd=0.59%，表明仪器精密度良好。

2.2.6  稳定性实验 

取供试品溶液，于0，1，2，3 h分别进样测定峰面积，结果rsd=0.42%。表明供试品在3 h内稳定。

2.3  体外透皮吸收方法

2.3.1  离体鼠皮的制备

取体质量20～22 g小鼠 ，乙醚麻醉，剪去背部毛，取皮肤剥离皮下脂肪及粘液组织,用生理盐水冲洗干净，备用。

2.3.2  接受液ph 7.4的磷酸盐缓冲液。

2.3.3  体外透皮实验装置及方法

本实验采用 franz扩散池装置。将备用鼠皮固定在扩散池的供应室与接受室之间，使角质层面向供应室，上下夹紧后在接受室中注满接受液，驱除气泡。在供应室中分别加入1 g样品凝胶(a )及( b)。开启电磁搅拌器连续搅拌,并保持水浴温度在( 32 ±0. 5 )℃。分别在 0.5，1，2，4，6，8，12 h取样4 ml，同时补加等量同温的新鲜接受液。

2.3.4  接受液含量测定

和累积透皮量的计算取接受液4 ml供试品溶液制备项下操作得到供试品溶液。取10 μl进样，在 254 nm处测得峰面积，代入标准曲线方程,得接受液浓度，并按以下公式计算累积释药量

   

（q）:c1=f(xi)；q=(ci×v∑n-1i=1+ci×4)/s。其中 f(xi):标准曲线方程；ci:接受液中药物浓度 ；v:接受液体积 ；s :扩散面积。

2.4  体外透皮吸收结果色谱分离结果见图1。

    结果以累积透皮释药量q对释药时间t作图 （见图2）。将数据进行模型拟合，渗透动力学符合higuchi函数方程，即a凝胶：q=2.751t1/2+0.704(r=0.995 3)，渗透速率为2.386 μg·h-1，而b凝胶：q=7.615t1/2+10.542(r=0.986 7)，渗透速率为7.619 μg·h-1。

经处方配伍后，大黄中主要成分大黄素的经皮渗透效果优于其单一药物大黄制成的凝胶剂。

3  讨论

    实验全部选择雄性昆明小鼠可便于取皮操作及结果数据的平行。同时以高效液相色谱法为离体鼠建立了可靠的体外测定方法，在渗透实验中，由于皮肤与介质长时间接触，皮肤中蛋白质等物质易脱落，溶解，会导致混浊或呈乳光，本文酸化样液以游离出脂溶性大黄素，然后氯仿提取，从而消除了皮肤中蛋白等成分对色谱柱的影响。

    体外透皮实验中水浴设定的温度为（32±0.5）℃系最接近正常人体表皮的温度。实验中的接受液ph设定在7.4也是因其接近人体皮肤的ph值。

    本实验中结果显示，由于处方中含有泽兰、侧柏叶、薄荷等其他成分，使双柏凝胶剂中大黄素的渗透作用提高，从此角度可以看出双柏凝胶剂用于局部具有一定透皮作用。但究竟是处方中的何种成分提高了大黄素的透皮吸收，由于时间及经费等方面的原因还有待于进一步的研究。