上皮细胞十篇

上皮细胞篇1

关键词：食管；上皮；干细胞

文章编号:1006-3617(2007)01-0120-04

中图分类号:R361+.3

文献标识码:A

1 食管上皮

食管的黏膜上皮是由一群复杂而有高度组织化的未角化复层扁平上皮排列而成。食管上皮可分为两个带：一是基底带，包括几层小的嗜碱性细胞，另一是分化带，包括多层规则排列的分化的鳞状上皮。基底带中贴近基底膜的一层细胞称为基底层，覆盖其上的数层称上皮基底层。位于上皮下的固有层规则的突向上皮基底层，形成高的状结构。所以，在解剖学上基底层可以进一步地分为两种成分：一种是扁平的称间基底层（the interpapillary basal layer，IBL），另一种是覆盖在表面的，称基底层（the papillary basal layer，PBL）。只有基底带的细胞才有分化能力，并且这种分化是以细胞从基底层移向食管腔面完成的，细胞的迁移、分化起始与分化标志物的表达结果有关。

2 干细胞的模型

上皮快速增生的信息显示上皮的结构可以用干细胞模型来描述。在这个模型中，上皮组织的恒定是由一些数量有限的分布在有分化能力的细胞层中的干细胞所决定的。干细胞的分裂有两个目的：填充干细胞缺失的间隙和产生迁移扩增细胞，迁移扩增细胞经过数次分裂后最终将进入分化路径。分化与增殖能力的降低有关，最终必导致分化产物的消失，在像食管上皮这一类仅有单一的分化路径的组织中，组织的更新是通过在细胞的迁移中不断扩大细胞数量来完成的。

在许多无脊椎动物中，干细胞的分裂总是产生一个干细胞子代和一个迁移扩增细胞，这种“不对称”在哺乳动物组织中却是少见的。在大多数哺乳类动物组织中，干细胞分裂有3种可能的结果：形成2个干细胞子代、2个迁移扩增细胞或两者各一个。在这种稳定状态中，干细胞和迁移扩增细胞间数量的平衡是由一个多反馈途径（数量不均）来维持的。

关于上皮干细胞性质的许多问题尚未解决，也不断有关于成熟组织比干细胞模型假设更具可塑性的新的认识产生［2，3］。然而，这个干细胞模型假设却提供了一个有用的框架给我们对体内的细胞行为进行概念化以及形成几种确定和分离干细胞的假设：① 相对于迁移扩增细胞群体，干细胞在处于稳定状态的体内中增殖的频率应更小；②当迁移扩增细胞的产物经过几次分裂后进入最终分化时，干细胞在体内和体外却有更强的增殖能力；③干细胞和迁移扩增细胞在功能上的区别可能由相关分子的不同功能水平来反映，对这些分子确定后才能对这2种细胞进行分离；④因为干细胞大体上并不启动一个分化程序，所以它们只是“原始的表现型”，即它们并不表达组织分化者的特征。

3 食管上皮干细胞的鉴定和分离

间基底层细胞在体内增殖呈现极不活跃和不对称特点。

近来，关于食管上皮细胞有丝分裂的详细分析及对增殖细胞的免疫组织化学染色研究证明了一个高度复杂和可预见的基底带细胞的增殖类型。首先，基底上层的增殖细胞远远多于基底层，其次，即使在基底层细胞中，PBL中的有丝分裂细胞也比IBL中的高出近4倍。再次，在基底层，细胞的有丝分裂是不协调的，相对于IBL，PBL中的细胞分裂是比较均匀的，可产生2个子细胞紧贴基底膜，相反地，在IBL中细胞分裂在本质上是不均匀的，其细胞分裂主要发生于基底膜的右角，产生一个停留于基底层的子细胞及一个进入基底上层的子细胞。

因此，IBL中的细胞就相当于食管上皮干细胞，它们在体内的增殖相对的不活跃，其分化产生一个仍停留于低增殖区的子细胞（假定存在的干细胞）和一个进入高增殖区的子细胞（假定存在的迁移扩增细胞）。

4 乳状间基底层细胞在体外有高度的增殖能力

在上皮基底层，黏附分子的表达水平是不均匀的。在滤泡间上皮内，真皮层内的基底角化细胞比网状组织桥内的基底细胞表达了更高水平的β1整合素（β1 integrin）。根据上皮基底细胞向前及侧面分布的特征，可以利用荧光活化细胞分类（FACS），将其与基底表层细胞分离，JONES和WATT［4］利用这种技术分离了滤泡间表皮基底角化细胞，并根据它们表达的β1 integrin的相对水平作进一步分离。他们发现约有20％最高水平表达β1 integrin的基底细胞具有体外快速增殖能力（培养2周后产生多于32个细胞），并且指出这样的克隆很可能起源于干细胞。因此，真皮的“整合素丰富区”代表了上皮基底层干细胞所在的位置。

同样地，食管上皮内的基底细胞也可以根据它们的FACS图与基底上层的角化细胞分离［5，6］，并且可以断定，食管基底层细胞的β1 integrin的表达水平也是不均匀的，令人惊奇的是，与PBL内的细胞相比，IBL细胞表达更低水平的β1 integrin，然而，当这两种区域的细胞根据它们β1 integrin水平用FACS分离，并按一定的克隆密度生长时，IBL层的细胞相应地产生两个层面，其中含有许多具有活跃增殖潜能的细胞克隆。

5 间基底层细胞在表现型上是原始幼稚的

在食管角质细胞分化过程中，几种细胞角质蛋白的表达是不同的［7］，VIAENE和BAERT利用原位杂交技术，已经发现在食管上皮基底层中，细胞角质蛋白mRNA（CKmRNA）的表达是不均一的［8］。在所有由内皮起源的复层扁平上皮包括食管上皮中，CK13蛋白都是由正在分化的角质细胞所产生［9］。在PBL及基底上层的细胞中，CK13 mRNA都存在高水平，在 IBL中的角质细胞中却缺失，并且，CK14和CK15的mRNA信号强度在IBL中也是不规则的，而在PBL及基底上层中这些mRNA都是高水平的，并且，在区从第二基底上层向上，分化标志物CK4的mRNA都是可检测的，但在间区到第三基底上层都不存在，所以，关于分化标志物，IBL细胞在组织中是分化最低的类型。

以上所讨论的观点与IBL中的角化细胞是干细胞及在食管上皮模型中干细胞和迁移扩增细胞存在于不同解剖部位，如干细胞存在于IBL层及迁移扩增细胞存在于基底上层中的观点是一致的。关于“假定存在的IBL干细胞比表皮干细胞表达相对低水平的β1 integrin的原因”将在下面进行讨论。

6 食管上皮具有意想不到的特性

食管的复层扁平上皮与表皮具有不同的功能和胚胎起源，或许这不足于让人感到惊奇，然而，它们在细胞行为和组成上也表现出很多不同点。首先，在食管表皮，干细胞和迁移扩增细胞存在于基底层，一些可获得的证据表明干细胞子代的命运是由它们之间数量的不均匀所决定的。而食管上皮，假定的干细胞和迁移扩增细胞则存在于各个独立的解剖位置上；其次，在IBL中干细胞的分裂似乎是按恒定的计划产生迁移扩增细胞，靠近基底膜右角的迁移扩增细胞分裂必然产生一个子细胞位于假定存在的基底上层迁移位置。这与胚胎系统中某些干细胞的行为是类似的，但这一现象在成年哺乳动物的食管上皮则很少见，在表皮中也不存在；再次，虽然表皮中的干细胞表达高水平的β1 integrin，而IBL中假定的干细胞却表达低水平的β1 integrin。表皮和食管角化细胞间的不同点可以反映了这两种细胞类型中，在不同干细胞功能控制下，上皮和间质间相互作用的不同点。

表皮干细胞的行为是不受其下基质作用影响的，表皮角化细胞可以不受真皮作用的影响而调节干细胞的增殖活度和数量。相反地，食管上皮基底膜在调控干细胞行为中却发挥了主导的作用。食管干细胞和基底膜的相互作用决定了细胞分裂方向的不对称和整个组织的结构层次。当在体外的真皮上培养食管角化细胞时，上皮基底层中细胞分裂的方向是随意的，这与体外表皮相似。相反地，当食管角化细胞在的带有完整基底膜的食管黏膜下层培养时，细胞分裂的方向却是绝大多数的不对称，形成带有明显的上皮，这与活组织是相似的。

在IBL中基底膜的成分在某种程度上为干细胞提供了一个适当微环境，这一观点也说明了消化道其他部分的主要状况。沿着基底膜成分中隐蔽的绒毛的轴所产生的区域性突变在确认消化道中干细胞本身状况上发挥了重要的作用。

恒定不变的干细胞分裂对不断增加的细胞需求是不易受到影响的。然而，类似于基底膜下的对称的细胞分裂在IBL中偶尔也可观察到，在IBL中，对称和不对称分裂的比例是否会被来自于周围组织的信号所改变仍是未知的。IBL中的细胞在S期中表现出特异的形态，这些细胞从一薄层胞质紧贴着基底膜，而核却转移进了基底上层。这样的形态也可见于神经上皮干细胞分裂时，有丝分裂内核的转移过程中。Jan等已经证明有丝分裂内核的转移过程中允许干细胞接受来自周围组织的信号，这些信号暗示了分子分布的不对称，因此也决定了细胞分裂的位置［10］。如果这种信号可以改变IBL中对称和不对称有丝分裂间的平衡状态，这将会提供一个关于阐明控制干细胞和扩增迁移细胞产物平衡的独创的机制，通过改变干细胞的数量，也将影响组织中新细胞产物的比例。

7 很多问题待于解决

虽然，图1所阐述的模型是复杂的，但却是一个大体简化的体内状态的描述，还有很多基本的信息有待于获取，IBL中每个细胞都有可能是干细胞，原位杂交技术已经表明IBL中几种角化蛋白的mRNA的表达水平是不同的，这些暗示了在这个区域，细胞功能还可能有进一步的亚分离，我们还不能从IBL中分离出单个或成组的细胞去确定它们在体外的性质，相似地，基底上层细胞也不能清楚地归入迁移扩增细胞的种类中，也还未发现有任何允许体外分离的细胞表面标志，因此，我们还不能确定它们的克隆能力，然而，我们却可以推测基底上层细胞是属于迁移扩增细胞的，因为它们的增生非常的频繁，即使与基底膜脱离接触，最终还是可以引起分化，并且，当食管基底细胞选择性地从外科样品中分离出，并在体外按一定的克隆密度培养时，形成的克隆> 85%，数量大且生长迅速（培养2周后> 32个细胞）。这可与表皮相对照，当表皮基底角化细胞在相似的状态下体外培养时，形成的克隆> 40%是数量小（< 32个细胞）且死亡的（主要表现出已分化细胞的形态）。JONES和WATT［4］质疑这种不成熟的克隆是否可以从迁移扩增细胞中得到，因此，在PBL和IBL细胞培养中不存在这些克隆与在食管基底层中不存在数量大的迁移扩增细胞。这些细胞似乎位于假设的IBL干细胞和基底上层的迁移扩增细胞之间。有趣的是，在体外，表皮角化细胞的克隆产物按integrin表达水平呈不同线性，因此，在表皮增殖区可能有一连续性细胞行为而不是严格地去划分干细胞和迁移扩增细胞的数量，食管上皮也有类似的状况，PBL细胞在功能上位于这两种细胞之间，然而，还没有关于划分IBL和PBL间细胞血缘关系的资料问世，图1的模型对此种关系也未作任何预测，关于是由IBL细胞间接扩充的假设也是有可能的，在此位置平行于基底膜的少见的分裂产物可能是由PBL细胞所产生的，在表皮，位于“整合素丰富区”的干细胞群表面所表达的Deltal和其周围细胞表达的Notchl间的相互作用在控制干细胞活性上起重要的作用，这种相互作用引发了干细胞群边缘的细胞分化，也保持了干细胞区域的解剖上的完整性及其大小，这种在IBL和PBL连接处的相互作用在控制它们的相关大小和组成上是否有重要作用还不太清楚，对食管中的Notch和Delta的表达类型也还未有详细的描述。

图1的模型没有结合食管上皮考虑它的腺体结构，管泡状腺体在黏膜下层沿着食管长轴排列，这些腺体的导管呈立方上皮排列，并开口于管腔，在终末部分变为复层排列。Gillen［11］ 等认为伴随着黏膜的损伤，来源于管泡腺体干细胞的表面上皮的重建是产生Barrett食管的来源，虽然还没有直接的证据证明在这些腺体中存在干细胞，但是它们的存在，将不会与我们这里讨论的模型发生冲突，事实上还可与表皮作对照，在表皮干细胞似乎不仅仅存在于滤泡内上皮，还存在于表皮的附属物，特别是毛囊鼓起的部位。详细的组织学和关于毛囊细胞生物学上的功能性分析尚未应用到食管腺体结构的研究中，这也是一块具有重要临床意义的领域。

8 疾病中的食管干细胞和迁移扩增细胞

食管上皮从正常的复层扁平上皮变为柱状上皮（Barrett食管）的化生在临床实践中的认识很紊乱，Barrett食管是后天形成的胃-食管返流疾病（GORD）［12］。在正常机体，食管和胃连接处存在一括约肌，可阻止胃内容物（胃酸和胆盐）返流入食管腔内，在40%以上的成年人中这种括约机制是不健全的，胃内容物可返流至食管腔中。Barrett化生发生于这其中的10%的个体中，Barrett食管是发生致命的食管腺癌的先兆。近年来，在发达国家，食管腺癌的发生率已增长了1倍。

关于Barrett食管起源于管泡腺干细胞的假设，可以认为十二指肠-胃返流也可以引起与食管口相类似的反分化，因为食管口没有腺体结构，所以暗示了这里的角质细胞的分化程序受到GORD的修饰，而发生柱状的分化，并且，由于胃返流物是不具遗传毒性的，所以胃食管返流在食管反分化的效应上代表了一个有丝分裂后的遗传外效应，而不是干细胞有异常，这一点是可能的，如胆盐通过血液系统实施调节细胞分化的效应［13］。近来，已经证明Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）的成分在调控表皮细胞中鳞状细胞和腺体细胞分化之间的平衡上起着关键的作用，虽然所谓的钙黏附素和连接素信号的异常已经被证明与Barrett食管进展到腺癌有关，但是在Barrett化生的主要病因上，这些通路的作用却还未被确定。

胃食管返流物可影响食管中迁移扩增细胞分化这一事实可能用GORD在食管上皮形态上的效应来说明，虽然，食管角质细胞在悬浮液中可以分化［14］，但是基底上层中假设的迁移扩增细胞却可以启动一个分化程序，就像可以通过几种分化标志物来证明一样，同时在体内也可继续分化，并且，这两种过程的相对比例似乎受到GORD的影响，因为图1中描述的所有层次的相对厚度在疾病中是不同的，由于GORD的存在，一种不确定的增殖刺激物导致了迁移扩增细胞的显著扩充，并且伴有的伸长、基底上层的增殖和已分化区的变薄。

假设在这篇综述中所描述的食管角化细胞的分离和培养方法不至于导致腺体成分的混乱，那么在体外剖析控制食管角化细胞分化和增殖的遗传和遗传外因素是可能的。

上皮细胞篇2

Induction of secretion of interleukin8 from lung epithelial cells by trypsin

【Abstract】　AIM: To investigate the actions of trypsin on the secretion of interleukin8 (IL8) from human lung epithelial cells. METHODS: A549 cells were cultured in a 12well culture plate. The challenge was performed by adding various concentrations of trypsin or trypsin inhibitor into each well， respectively. After 2 h， 8 h or 16 h， the reactions were terminated by removing the supernatant from each well. A sandwich ELISA was used to determine the levels of IL8 in supernatants. RESULTS: Following 16 h incubation， trypsin induced the secretion of IL8 in a concentration dependent manner. As low as 1 μg/L trypsin was able to induce IL8 release from epithelial cells and the maximum of accumulated release of IL8 was observed with 3 μg/L trypsin， which was 5fold more than the baseline release. However， when trypsin concentration increased over 3 μg/L， the extent of increased secretion of IL8 decreased. Soybean trypsin inhibitor (SBTI) and α1antitrypsin (α1AT) inhibited trypsin induced secretion of IL8. The time course showed that the actions of trypsin initiated at 2 h and reached their peak at 16 h. CONCLUSION: Trypsin is a potent secretogogue of IL8 release from cultured human lung epithelial cells， indicating that it is likely to be involved in the pathophysiological process of airway inflammation.

【Keywords】 trypsin；epithelial cells; interleukin8; lung

【摘要】 目的： 探讨胰蛋白酶对人上皮细胞白细胞介素8（IL8）分泌的影响. 方法： 人肺上皮细胞系A549细胞分别接种于12孔培养板各孔内，并分别用不同浓度的胰蛋白酶和/或胰蛋白酶抑制剂进行刺激. 刺激时间为2 h、8 h和16 h. 用ELISA方法检测上清液中的IL8水平. 结果： 经过16 h的培养，胰蛋白酶可引起浓度相关性IL8释放，胰蛋白酶在浓度1 μg/L时就可引起IL8的释放量增加，3 μg/L时诱导IL8的释放量达高峰，为基础分泌量的5倍，但随着胰蛋白酶浓度的增加，IL8的释放量反而下降. 胰蛋白酶抑制剂可以抑制胰蛋白酶诱导IL8释放的作用. 时间相关曲线表明，胰蛋白酶从2 h起即可引起IL8释放，16 h达高峰. 结论： 胰蛋白酶可促进人肺上皮细胞分泌IL8，表明它能积极参与呼吸道的炎症过程.

【关键词】 胰蛋白酶；上皮细胞；白细胞介素8；肺

0引言

蛋白酶激活受体（protease activated receptor， PAR）属G蛋白耦联受体家族中的亚类，目前有PAR14 4个成员组成，PAR2可在人呼吸道上皮细胞和多种呼吸道肿瘤上皮细胞系表面表达［1-5］. 胰蛋白酶主要由胰腺分泌，在体内主要参与肠道消化功能. 最近研究表明，胰蛋白酶还是PAR2的激动剂，胰蛋白酶在人PAR2的R34?S35LIGKV处切断受体的N末端暴露系锁配体SLIGKV，从而激活PAR2参与肺部炎症［6］，而PAR2的缺乏可以降低气道炎症反应［7］. 因此，我们利用人肺癌上皮细胞系A549细胞探讨胰蛋白酶对上皮细胞IL8分泌的影响.

1材料和方法

1.1材料

胰蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、α1抗胰蛋白酶(α1AT)、青、链霉素均购于Sigma公司，DMEM 培养液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶EDTA消化液均购自Gibco公司.

1.2方法

1.2.1细胞培养人肺癌上皮细胞系A549细胞（购自中国科学院上海细胞研究所）接种于50 mL培养瓶内，用DMEM完全培养液（含100 g/L FBS， 10×104 U/L青霉素和100 mg/L链霉素），于37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养.

1.2.2上皮细胞激发实验待细胞铺满瓶底后，用2.5 g/L胰蛋白酶EDTA消化液消化，将获得的细胞分种于12孔培养板各孔内，用1 mL完全培养液培养至细胞相互融合后，换无血清培养液培养16 h. 然后向每孔的细胞内加入不同浓度的胰蛋白酶和/或胰蛋白酶抑制剂进行激发实验. 胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶加入细胞前在冰上孵育30 min，细胞培养2， 8和16 h后收集上清液，离心后于-80℃冻存. 全部实验为双样，每组实验均重复5次.

1.2.3细胞上清IL8水平检测用人IL8 ELISA检测试剂盒（Biosource）， 检测细胞上清液中的IL8水平，并用酶标仪 (Molecular Devices公司) 于450 nm波长处测定吸光度（A）.

统计学处理： 数据以x±s表示，采用SPSS(11.0版)软件进行单因素方差分析，组间方差不齐时采用非参数秩和检验. P

2结果

2.1胰蛋白酶对肺上皮细胞系IL8释放的影响经过16 h的培养，胰蛋白酶可引起浓度相关性IL8释放增加， 胰蛋白酶1 μg/L时就可引起IL8释放量增加， 3 μg/L时达高峰，为基础分泌量的5倍，但随着胰蛋白酶浓度的再增加， IL8的释放量反而下降 （Fig 1）. 时间关系曲线显示，胰蛋白酶引起A549细胞分泌IL8从2 h起就有所增加，16 h增加最显著（Fig 2）.

2.2胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶诱导释放IL8的抑制作用胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶与A549细胞共同培养16 h后结果显示：SBTI在浓度为10和30 mg/L时可分别抑制胰蛋白酶诱导的A549细胞释放IL8的作用（Fig 3）. α1AT在浓度为10 mg/L也能抑制胰蛋白酶引起的IL8释放（Fig 4）.

3讨论

研究表明，PAR2激活能介导气管平滑肌的收缩、促进炎症性细胞的游走和血管的通透性增加，介

n=5. bP

导嗜酸性粒细胞的浸润［8］，调节血管舒张与收缩，调节消化道和皮肤的功能等［9］. 呼吸道上皮细胞PAR2的激活还可导致基质金属蛋白酶（MMP9）［10］、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）［1，2］、酸性粒细胞趋化因子［4］、前列腺素E2（PGE2）、白细胞介素（IL）6等［4］细胞因子的释放，提示PAR2可能参与气道的炎症和重塑. 激活PAR2的蛋白酶主要有胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶及凝血因子Ⅶa， Xa［11］.

我们的研究表明，胰蛋白酶对呼吸道上皮细胞IL8的分泌有显著促进作用，表明胰蛋白酶能通过激活PAR积极参与呼吸道的炎症过程，间接证明了PAR在哮喘和慢性阻塞性肺疾病的发病过程中起着一定的作用. 胰蛋白酶可引起肺上皮细胞高达5倍的IL8释放，表明它对IL8的释放促进作用是高效的. IL8的释放量高达1.7 μg/L，达到了IL8发挥其生理和病理生理功能的浓度. 胰蛋白酶抑制剂SBTI对胰蛋白酶诱导IL8释放的抑制作用，表明胰蛋白酶的作用是通过其水解活性实现的，也表明胰蛋白酶抑制剂可能有抗炎作用. α1抗胰蛋白酶对胰蛋白酶诱导的IL8释放也具有抑制作用，它作为机体内源性的胰蛋白酶抑制剂可能在呼吸道的抗炎反应机制中起一定作用.

从时间关系曲线上看，胰蛋白酶对IL8分泌的刺激作用是一个比较缓慢的过程，这可能表明分泌出的IL8是由上皮细胞新合成的，而不是原有贮存的IL8的单纯释放.

我们发现，A549细胞系可同时表达PAR14四种受体［12］，而胰蛋白酶既可酶切PAR2又可酶切PAR4从而激活受体，因此，胰蛋白酶引起的肺上皮细胞IL8的释放，是单纯由PAR2或PAR4介导还是PAR2与PAR4同时参与，值得进一步探讨.

【参考文献】

［1］ Vliagoftis H， Befus D， Hollenberg MD， et al. Airway epithelial cells release eosinophil survivalpromoting factors (GMCSF) after stimulation of proteinaseactivated receptor 2 ［J］. J Allergy Clin Immunol， 2001;107(4):679-685.

［2］ Sun G， Stacey MA， Schmidt M， et al. Interaction of mite allergens Der p3 and Der p9 with proteaseactivated receptor2 expressed by lung epithelial cells ［J］. J Immunol， 2001;167(2):1014-1021.

［3］ Asokananthan N， Graham PT， Fink J， et al. Activation of proteaseactivated receptor (PAR)1， PAR2， and PAR4 stimulates IL6， IL8， and prostaglandin E2 release from human respiratory epithelial cells ［J］. J Immunol， 2002; 168(7):3577-3585.

［4］ Cocks TM， Fong B， Chow JM， et al. A protective role for proteaseactivated receptors in the airways ［J］. Nature， 1999; 398 (6723):156-160.

［5］ Miotto D， Hollenberg MD， Bunnett NW， et al. Expression of protease activated receptor2 (PAR2) in central airways of smokers and nonsmokers ［J］. Thorax， 2002; 57(2):146-151.

［6］ Vergnolle N， Wallace JL， Bunnett NW， et al. Proteaseactivated receptors in inflammation， neuronal signaling and pain ［J］. Trends Pharmacol Sci， 2001; 22 (3):146-152.

［7］ Lindner JR， Kahn ML， Coughlin SR， et al. Delayed onset of inflammation in proteinaseactivated receptor2deficient mice ［J］. J Immunol， 2000; 165(11):6504-6510.

［8］ Schmidlin F， Amadesi S， Vidil R， et al. Expression and function of proteinaseactivated receptor 2 in human bronchial smooth muscle ［J］. Am J Respir Crit Care Med， 2001;164(7):1276-1281.

［9］ Macfarlane SR， Seatter MJ， Kanke T， et al. Proteinaseactivated receptors ［J］. Pharmacol Rev， 2001; 53(2):245-282.

［10］ Vliagoftis H， Schwingshackl A， Milne CD， et al. Proteinaseactivated receptor2mediated matrix metalloproteinase9 release from airway epithelial cells ［J］. J Allergy Clin Immunol， 2000; 106 (3):537-545.

上皮细胞篇3

目前,大肠癌已是欧洲排名第2位的肿瘤致死性疾病,占肿瘤致死性疾病的10%左右.引起大肠癌发生的原因众多,如基因突变引起的家族性腺瘤肉病(familialadenomatouspolyposis,FAP)、DNA错配修复基因(MMR)突变引起的遗传性非息肉性结肠癌(herediarynonpolyposiscol-orectalcancer,HNPCC)、Crohn's病、溃疡性结炎、上皮细胞内癌基因激活和抑癌基因失活等均与大肠癌的发生发展密切相关[1].上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是指在生理或病理情况下发生细胞上皮-间质转变,同时伴随细胞形态与相关基因表达的改变.EMT在胚胎形成以及组织器官发育过程中也起着重要作用(如中胚层和神经冠结构形成以及心脏形态发生过程[2]),但也可引起器官纤维化和参与肿瘤形成过程,在此过程中上皮细胞顶-底极性改变、桥粒等紧密连接结构消失、细胞骨架重组,波形蛋白表达上调、角蛋白表达下调,从而使细胞离体、获得迁移能力,并能抵抗细胞凋亡[3].近来研究发现EMT在大肠癌发生发展过程中起着重要作用,并与肿瘤细胞的浸润和转移有着非常密切的关系.1EMT在炎症促进大肠癌发生发展中的作用慢性炎症被认为是包括大肠癌在内的许多种人类肿瘤疾病的原因之一,流行病学和临床研究均证实两种主要的炎症性肠病(inflammatoryboweldisease,IBD):溃疡性结肠炎和Crohn's病[4]发展成大肠癌的风险明显升高.慢性炎症可以通过诱导细胞DNA修饰导致肠上皮细胞发育不良,此外还可通过DNA甲基化和组蛋白修饰等作用影响肠上皮发育过程[5].Bataille等[6]在Crohn's病瘘管形成过程中发现肠道上皮标志物E-cadherin和?-catenin表达降低(?-catenin在EMT的起始阶段合成增加,而在EMT最终阶段合成明显减少[7]);间质标志物?-integrin表达增多(TGF-?激活EMT的过程依赖于?-integrin,然后通过Smad3依赖性的转录过程或者非Smad3依赖性、p38MAPK激活和GTP酶调节的信号传导途径[8]),而该蛋白随着EMT的进展逐渐由胞膜向胞质、胞核转移,?-catenin移位被认为是Crohn's病发展过程中EMT的关键分子步骤.

在肿瘤相关炎症(cancerrelatedinflammation,CRI)相关分子中发现一些重要的始动因子,包括NF-?B、STAT3[9]、IL-1?、IL-6、IL-10和TNF-?等.NF-?B是一种关键的内源性炎症/免疫调节因子[10].Douglas等在大肠癌细胞中发现了异常的NF-?B调节,且证实在结肠肿瘤起始和发展中NF-?B和CRI之间存在密切联系,通过靶向灭活IkappaB使肿瘤浸润白细胞中NF-?B失活抑制了炎症相关大肠癌的发生,从而为结肠肿瘤中NF-?B和炎症细胞的作用提供了基因水平证据.IL-6是NF-?B激活的一个主要效应分子,并且与STAT3存在密切关系,他具有促进生长和抗凋亡能力[11].研究发现IL-6能保护正常肠上皮细胞和癌前细胞免受凋亡,并促进肿瘤起始细胞增殖,在此过程中NF-?B-IL-6-STAT3通路起着重要作用.Lee等[12]发现大肠癌中NF-?B的活化状态需要STAT3维持,提示STAT3是肿瘤细胞增殖和存活的关键因子,并调控了c-Myc、Mcl-1、CyclinD和Bcl-2表达[13].抑制因子从不同水平上调控NF-?B信号通路,Tir8是表达于肠黏膜上IL-1R家族的一员,他能够通过阻止IRAK-1和TRAF-6,抑制信号从IL-1R/TLR复合物传导[14].在小鼠大肠癌肿瘤模型中发现NF-?B下游分子CCL2、CCL3、IL-1和IL-6能够促进炎症相关的肿瘤形成,并发现NF-?B激活过程中Tir8的缺失直接导致了大肠癌形成[15].肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophages,TAM)分泌的TNF通过抑制GSK-3?促进了Wnt/?-catenin信号传导,促进了结肠上皮细胞向间质转化,此过程在大肠癌发展中起着重要作用[16].此外,炎症细胞中NF-?B激活也造成了COX-2和ROS水平升高,ROS能诱导DNA损伤、DNA甲基化、转录后修饰和肿瘤抑制基因突变等[7];控制炎症反应和诱导肿瘤细胞凋亡的TGF-?和低氧诱导因子-1(hypoxia-induciblefac-tor-1,HIF-1)同样是炎症微环境中促使上皮细胞发生间质转化的潜在诱导因子[17].Grivennikov等[17]证实IL-6与其受体sIL-6?结合后停留在细胞表面并能借助胞内TGF-?通路促进结肠上皮向恶性转化;IL-10激活STAT3(信号传导蛋白-转录激活物)后通过与IL-6相似的途径介导细胞恶性转变[18].TGF-?作为炎症因子可造成包括肠道在内的多器官自身免疫性疾病,且可激活多种信号通路如Erk、c-Jun、JNK、PI3K和RhoA等[19],也能诱导某些转录因子和转录调节因子在EMT中的表达,包括?EF1、SIP1和Snail等,从而有利于结肠上皮EMT的发生[20].TNF-?在IBD发病机制中是一种重要的炎症因子,在炎症相关大肠癌(colitisas-sociatedcolorectalcancer,CAC)中也起着重要作用[21],TNF-?在CAC中主要依赖激活胞内转录因子NF-?B进行信号传导,通过NF-?B的多向性转录激活作用(NF-?B可以结合至靶基因MMP-9、IL-8、uPA、VEGF、CXCR4、骨桥蛋白等的启动子或增强子之上进行调控[22])诱导结肠上皮细胞向肿瘤细胞分化、增殖,并抑制细胞凋亡、促进肿瘤侵袭和转移[23].此外,其他炎症因子如IL-12、IL-13和INF-?等在慢性大肠炎发展过程中也参与了肿瘤形成过程,而TGF-?、IL-10则能在此过程中发挥协同作用[24].目前已证实上述参与炎症发生和发展的各种细胞因子如,TGF-?、TNF-?和NF-?B等均是EMT信号通路的关键因子,可见EMT参与了炎症促进大肠癌发生和发展的相关过程,但是EMT在此过程中的详尽机制尚待进一步研究.

2EMT在腺瘤肉病相关的大肠癌发生发展中的作用

FAP在结肠腺瘤肉疾病中占有主要地位,相关研究证实位于染色体5q21的APC突变失活是FAP的主要原因[25],APC突变被认为启动了大肠癌发生的多步骤过程,最终FAP往往发展成为大肠癌[26].与FAP相同的是绝大多数散发大肠癌病例起源于结肠腺瘤且同时伴有APC突变.Vécsey-Semjén等[27]证实小鼠敲除APC外显子exon14后可导致结肠腺瘤发生,免疫组织化学检测该模型结肠上皮细胞中可见Wnt信号通路的关键因子?-catenin在胞质和胞核中积累,且编码C-Myc和CyclinD1的mRNA也显著增加.APC是一种肿瘤抑制基因,可以作为Wnt/?-catenin的负性调控因子,在正常结肠上皮细胞APC/?-catenin复合物被丝氨酸-苏氨酸激酶(GSK3?)磷酸化,导致?-catenin降解,而在APC突变失活及Wnt信号转导通路开启时GSK3?的磷酸化作用被抑制[28],使其不能诱发?-catenin降解,从而造成胞质内的?-catenin持续累积,后者作用于靶基因C-Myc和CyclinD1等,最终导致Wnt通路介导的EMT发生,正常结肠黏膜上皮向间质转化,最终结肠上皮细胞发生恶性转化[29,30].Lochter等[31]利用COGA-8结肠上皮细胞培养发现CyclinD1与CDK4、CDK6结合,诱导生成CyclinA和CyclinE,再与CDK2结合从而使结肠上皮细胞从G1期进入S期.C-Myc启动子区域有?-catenin结合位点,因此C-Myc表达可以被Wnt通路上调,C-Myc过表达使其结合至CyclinD2启动子特定的DNA序列并促进CyclinD2的转录过程[32].Wnt通路还能直接上调CyclinD1,因为CyclinD1启动子区域包含LEF-1结合位点,而该位点被认为是Wnt通路的直接作用靶点[33].?-catenin在胞核内与淋巴细胞增强子结合因子1(LEF-1)和T细胞因子-4(Tcf-4)结合并作为转录共激活子启动下游基因(Slug、Cdx-1、Id2和ENC1等)表达.APC上?-catenin结合位点的减少程度与Wnt通路中?-catenin/LEF-1/Tcf-4复合物增加的程度呈负相关[34],而?-catenin/LEF-1/Tcf-4的增加导致了结肠上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1减少、胞间桥粒等连接蛋白降解、细胞骨架重组、细胞离体和获得迁移能力[35],还可以直接作用于AP-1转录因子复合物中c-jun和fra-1的启动子部位使该转录复合物增多、上调uPAR转录[36].此外,该复合物还能上调ZEB1表达(高表达于FAP腺瘤、结肠腺癌上皮细胞,且与胞核?-catenin水平呈正相关[37]),而ZEB1能抑制E-cadherin生成[38],且该转录激活复合物参与了腺瘤转变为腺癌甚至肿瘤转移的全过程[39].以上过程最终使结肠上皮细胞经历EMT过程(如细胞间连接蛋白降解、细胞迁移能力增强和获得间质表型等)并向恶性转化.另外,CK2?是一种高度保守的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,可以磷酸化多种底物并在多种生理病理过程中起重要作用[40].正常结肠上皮细胞逐渐演变成腺瘤或腺癌的过程被认为与EMT及E-cadherin、Vimentin和?-catenin等基因表达改变紧密相关.Zou等[40]发现CK2?表达于正常结直肠上皮细胞和结直肠腺瘤/腺癌细胞,通过调节参与细胞周期的癌基因c-myc和抑癌基因p53和p21等影响了大肠癌的演变过程.CK2?敲除或转染CK2?SiRNA后上皮标志物E-cadherin表达显著升高、间质标志物vimentin表达降低,还能造成细胞中转录因子Snail1、Smad2/3和癌基因c-myc的表达下降,以上结果说明CK2?能够对上皮间质转变起到某种程度的抑制作用,但是CK2?影响结肠腺瘤向大肠癌转变的具体机制尚未完全明确.

3microRNAs介导的EMT在大肠癌发生发展中的作用

microRNAs是一类长度在18-25nt的单链寡核糖核苷酸的非编码RNA,具有高度的保守性、组织特异性和发育时序性[41],在转录后水平通过负向调节mRNA发挥其功能,与mRNA的靶向识别以与3'末端UTR互补性结合为基础[42].mi-croRNAs翻译水平的抑制作用常伴随由poly(A)尾加速脱腺苷化和后续核酸外切消化导致的靶mRNA水平减少[43],而且microRNAs控制其靶点特异性的关键区域在5'末端2-7个碱基对的种子序列[44],可以在细胞增殖、分化、凋亡、新陈代谢及胚胎发育等过程中起调控作用[45],部分microRNAs通过调控癌基因和肿瘤抑制基因的表达;部分通过直接作为癌基因或肿瘤抑制基因参与了大肠癌的病理过程[46].虽然microRNAs参与大肠癌发生发展的相关研究较多,但有关microRNAs在大肠癌中介导EMT的研究仍较少.研究证实在许多原发肿瘤及相应转移瘤中存在不同程度的microRNA表达,在蛋白络氨酸磷酸酶(PTP)Pez诱导MDCK的细胞系中发现了TGF-?参与EMT的过程,因为在该细胞系中发现了细胞间连接缺失和间质表型过表达.此外通过RT-PCR还发现miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和249)及miR-205表达的下调,而稳定的miR-200s过表达可以阻止TGF-?诱导的EMT,提示miR-200s是EMT的关键调控因子,且miR-200s是通过抑制ZEB1和SIP1的翻译来调控EMT的[47].关于miR-200家族、ZEB1和SIP1,我们推测上皮细胞和间质细胞表型之间的转化是由ZEB1和SIP1的水平决定的.ZEB1和SIP1结合至目的基因如上皮细胞关键基因E-cadherin启动子成对的ZEB样E-Boxs(CACCTG)上从而抑制这些基因的转录[48].以上证据提示miR-200s的丢失可能导致肿瘤的侵袭性增强,甚至造成远处转移.TGF?、TNF?由浸润的炎症细胞或肿瘤细胞产生,已被证实能够诱导结肠癌细胞发生EMT,在结肠癌SW480细胞系中通过miRNA表达分析发现稳定敲除ZEB1能够导致胞间连接蛋白E-cadherin表达上调、细胞迁移和侵袭的能力下降,而miR-141、miR-200b和miR-200c的表达水平明显升高,且miR-141、miR-200c的表达上调最为明显.此结果也被RT-PCR检测所证实,提示这两种miRNA参与了结肠癌EMT过程[49].而Colwell[50]利用TGF?/TNF?诱导LIM1863大肠癌细胞发生EMT的过程中发现miR-21和miR-31表达水平明显升高;蛋白定量分析发现miR-21和miR-31促进了TGF?诱导的EMT的过程,与miR-200抑制EMT上游调控因子ZEB1/2不同,miR-21和miR-31主要作用于EMT下游因子T淋巴瘤侵袭转移蛋白1(TIAM1),后者是一种RacGTPase交换因子[51].此外,miR-9和miR-335通过直接抑制E-cadherin和SOX4合成促进了大肠癌细胞转移.以上结果说明某些microRNA可以在TGF-?信号通路的下游发挥作用从而促进结直肠癌的发生和转移.启动子超甲基化和肿瘤抑制基因沉默是肿瘤形成的重要分子标志.Davalos等[52]通过大肠癌原发肿瘤微切除证实5'-CpG岛超甲基化相关的miR-200b/200a/429和miR-200c/141多顺反子转录沉默是调节EMT和MET转变的重要步骤,也是大肠癌肿瘤进展的关键,并发现miR-200超甲基化和ZEB1/ZEB2上调与CDH1、CRB3和LGL2表达下调相关;TGF?诱导的EMT中miR-200超甲基化失活伴随着E-cadherin丢失和Vimentin增加[53];Twist基因启动子获得CpG岛超甲基化后即可诱导结肠上皮细胞发生间质转化.此外,其他组蛋白修饰基因,如LSD1、CREB结合蛋白、SIRT1等也参与了EMT过程.deKrijger等[46]发现36%的大肠癌原发肿瘤中miR-34a表达下降,部分归因于TP53的突变,部分是由于启动子甲基化;EMT激活因子TGF?上调也促进了miR-21和miR-31表达,后两者在大肠癌中促进了TGF?诱导的EMT过程.此外,miR-373、miR-126和miR-196a转染的大肠癌细胞则显示出明显肺转移潜能.Sreekumar等[54]证实E-cadherin表达受miR-9直接调控而转录抑制,miR-199和miR-218则是间质特征性蛋白N-cadherin的潜在直接调控mi-croRNA.miR-138、miR-488和miR-151能够在EMT过程中调节FAK的表达水平从而影响大肠癌肿瘤细胞的迁移能力.

4大肠癌中EMT的有关信号通路在EMT介导大肠癌发生发展过程中伴随着众多信号通路的激活,将胞外信号传导入胞内引起E-cadherin、Vimentin等异常、表型改变、基底膜降解、上皮细胞向间质转变和细胞迁移等一系列变化,最终导致正常结肠上皮细胞转变为大肠癌细胞.

4.1Wnt/?-catenin和FGF信号传导通路Wnt信号需要通过标准和非标准的信号通路传导,FGF信号通过PI3K-AKT、MAPK和PLC?通路传导.GSK3?是Wnt标准信号传导通路和FGF依赖性PI3K-AKT信号传导通路的关键分子.标准的Wnt信号通路决定细胞的分化方向,非标准的信号通路控制细胞的极性和运动潜能,前者通过卷曲家族受体(Frizzled)和LRP5/LRP6受体进行信号转导,后者通过Frizzled和ROR1/2共同受体进行信号传导.LRP5和LRP6是LDL家族的蛋白分子,胞外有Wnt结合位点,胞内有Axin模体结构.除Wnt信号外,?-catenin为实现在蛋白化及蛋白酶体介导的降解而与GSK3?结合并被后者磷酸化[55],标准的Wnt信号诱导Friz-zled-Dishevelled复合物与LRP5/LRP6-AXIN-FRAT结合,使?-catenin从GSK3?释放,最终在胞核中稳定的累积.?-catenin与TCF/LEF、BCL9/9L结合成TCF/LEF-?-catenin-Legless-PYGO复合物,作为Wnt信号通路的效应物[56].非标准Wnt信号通路中ROR1和ROR2是受体型络氨酸激酶,胞外为Wnt结合位点,胞内为CKI?结合结构域,RhoA、c-JUN、N末端激酶(JNK)、Nemo样激酶(NLK)是非标准Wnt信号通路的效应物.FGF与受体结合后诱导受体二聚化、络氨酸激酶活化及受体自身磷酸化,FRS2、FRS3和PLC?与磷酸络氨酸残基相互作用被募集至FGF受体,然后FRS2/3招募GRB2、SHP2,FRS2/SHP2/GRB2复合物募集GAB1激活PI3K,导致GSK3?活性下降、Snail-EMT级联反应激活、E-cadherin/?-catenin表达下调、结肠上皮细胞恶性转化,最终参与了大肠癌的发生发展过程[57].基因分析发现Dishevelled是Wnt通路的正向调控蛋白,它发挥作用时处于受体下游、?-catenin的上游,能导致c-Myc和cyclinD基因在结肠癌细胞中出现扩增[58].

4.2Ras信号传导通路Ras蛋白在调节大肠癌发生发展的信号通路中起着重要作用.生长因子活化的受体激活后,活化的Ras通过Raf激酶激活MAPK激酶(MEK1、MEK2),导致胞外ERK1、ERK2激活[59].ERKs位移至细胞核并激活核转录因子,如Elk-1、ATF-2、ETS1/2,使癌基因转录迅速开启.首先,BRAF是Raf家族的一员,他的突变与增强了的激酶活性有关,且在9%-11%的结直肠癌中发现此现象;其次,在30%-40%的腺瘤和76%的结直肠癌肿瘤中证实MEK磷酸化及激活;再次,结直肠癌中呈现ERK的高度激活,且证实ERK1、ERK2活性在肠道肿瘤中明显升高;最后,试验证实阻断MEK/ERK抑制了结肠癌细胞的生长,表明ERK参与了结肠癌细胞的增殖.MEK1通过Egr-1、Fra-1增强Snail1/2表达而下调E-cadherin[60].另有研究证实结肠上皮细胞表达活化的MEK1获得了向肿瘤细胞转变及转移的潜质.除MAPK途径外,Ras还可通过PI3K和RhoGTPase或与TGF-?协同诱导大肠癌EMT.PI3K激活后影响EMT过程的机制如前所述;此外,PI3K/Akt能够使RhoGTPase激活,也能与TGF?通路相互作用从而影响大肠癌EMT过程[61].

4.3PI3K信号传导通路磷酸酰肌醇3激酶(PI3K)通路对正常细胞代谢、生长及肿瘤进展起着重要作用.PI3K的抑制因子PTEN缺失(10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源敲除)与结肠肿瘤相关,证实PI3K信号通路在大肠癌发生过程中起着重要作用.近年来研究提示66%-70%的大肠癌中PTEN表达下调,且与微卫星不稳定紧密相关.此外还证实TNF?造成了PTEN下调.IEC-6和HIE细胞敲除PTEN后?-catenin表达水平明显升高,大肠癌SW480细胞中V-catenin表达也有轻度升高,提示?-catenin的表达受PTEN调控.利用LY294002或Wortmannin抑制PI3K降低了c-Myc和cyclinD1表达,而在RIE-1细胞中敲除PTEN则显著上调了上述蛋白的表达;同样在IEC-6和HIE细胞中使PTEN沉默增加了c-Myc和cyclinD1的表达,说明PTEN丢失可以通过促进细胞增殖、抑制凋亡而影响大肠癌的发生[62].Bowen等[63]发现在野生型PTEN结肠肿瘤细胞中Akt2过表达导致了肿瘤微转移的形成,提示Akt可能是作为TGF-?1下游调控因子发挥作用的.PI3K/Akt通路下游的效应分子mTOR激酶调控着CRC肿瘤的发生,且证实mTORC1和mTORC2通过RhoA和Rac1通路调控着结肠癌细胞的迁移能力.

4.4Notch和Hedgehog信号传导通路Notch通路在胚胎发育和内环境稳定中发挥着重要作用,其异常激活参与了多种肿瘤的发展过程.该通路激活是由Notch配体(Jag1、Jag2、DLL1、DLL3和DLL4)结合至相应受体上引起的.配体在细胞外被蛋白酶裂解、在胞内被?-分泌酶裂解[64],使得Notch胞内结构域(NICD)转至细胞核,在胞核中与CSL和其他共刺激因子如Maml1、2、3构成转录激活复合物,最终激活Notch通路的靶基因Hes和Hey1,使上皮细胞恶性转化.研究显示大肠癌EMT的诱导因子ZEB1可通过抑制miR-200表达而稳定Notch通路的Jag1、Maml2和Maml3,并证实ZEB1通过提高Jag1的表达而增强Notch通路激活通路存在交互作用[66].虽有研究[67]证实Hedgehog通路能诱导Snaill表达上调,但是尚未证实Hedgehog对Snaill有直接转录激活作用.另外Hedgehog能诱导JAG2表达上调、促进TGF?分泌[68],TGF-?1激活使胞核内NF-?B调控的ZEB1和ZEB2表达上调,同样使Smad-Sp1调控的间质标志物Vimentin等表达上调从而促进大肠癌细胞迁移及侵袭.

上皮细胞篇4

【关键词】 bcl2基因

【Abstract】 AIM：To observe the effect of bcl2 gene transfection on the proliferation of human gastric epithelial cell GES1. METHODS：The eukaryotic vector carrying the full length of bcl2 gene and the neomycin resistance gene (pcDNA3/bcl2) and the one only carrying the neomycin resistance gene (pcDNA3) were amplified and purified. The plasmid of pcDNA3/bcl2 was used to transfect GES1 cells by using the lipofectamine， and the empty vector pcDNA3 to transfect GES1 cells as controls. And then， the cells were cultured in 1640 culture medium containing an appropriate concentration of G418 for selection. The method of HRP label immunohistochemical staining was used to identify the cells expressing bcl2 gene positively. The morphologic changes of GES1 cells were observed under an optical microscope by HE staining. The cell proliferation affected by the transfection of bcl2 was measured by cell counting and MTT assay. RESULTS: bcl2 gene and the vector pcDNA3 were transfected separately into GES1 cells by lipofectamine. After G418 selection， the cells were transfected steadily. Compared with controls， HRP label immunohistochemical staining showed that bcl2 gene transfected cells expressed Bcl2 protein much more obviously. No morphologic changes were observed by HE staining. The growth curve was drawn by the method of cell counting，which showed that the growth of bcl2 gene transfected cells was faster than that of empty vector transfected cells and untransfected cells after 6 d culture. And MTT assay showed that the growth of bcl2 gene transfected cells were 4.15±0.31，5.98±0.56 and 8.94±0.79， respectively. While MTT assay showed that the growth of control cells were 3.01±0.20， 4.76±0.52 and 7.69±0.84， respectively. Significant differences were found between the 2 groups (P

【Keywords】 bcl2 gene; transfection; gastric mucosa; epithelial cell; GES1; proliferation

【摘要】 目的：观察bcl2基因脂质体法转染人胃上皮细胞系GES1及其转染后对GES1细胞增殖的影响. 方法：以脂质体法转染构成bcl2基因表达的人胃上皮细胞系GES1细胞模型，空载体质粒pcDNA3转染GES1细胞及正常GES1细胞为对照；经酶标免疫组织化学法鉴定bcl2基因表达阳性细胞；用HE染色法进行形态学观察；并采用细胞计数及MTT法分析bcl2转染后对GES1细胞增殖的影响. 结果：脂质体法转染bcl2基因后，细胞高表达Bcl2蛋白；HE染色后形态学观察无明显改变；细胞计数法绘制细胞生长曲线结果显示bcl2基因转染6 d后细胞生长速度明显超过对照组，MTT法结果显示bcl2基因转染第24，48，72 h， A490 nm值分别为4.15±0.31，5.98±0.56，8.94±0.79，对照组分别为3.01±0.20，4.76±0.52，7.69±0.84，两组相比较具有显著性差异(P

【关键词】 bcl2基因；转染；胃黏膜；上皮细胞；GES1；增殖

0引言

胃癌的发生是一个多因素、多阶段的发展过程. bcl2是近年发现的细胞凋亡调控基因，其异常表达与胃癌、宫颈癌、胃肠道等肿瘤发生发展尤为密切［1-3］. 我们探讨bcl2基因在人胃上皮细胞系GES1中的表达情况，探讨该基因表达量与人胃上皮细胞生长特性之间的关系如下.

1材料和方法

1.1材料正常人胃上皮细胞系GES1，本室保存；质粒pcDNA3由日本北海道大学医学部遗传医学研究所肿瘤病毒学部门高田贤藏教授惠赠；Lipofectamine、DMEM培养液、RPMI 1640培养液、MTT、胎牛血清购于Gibco公司；小鼠抗Bcl2（一抗）、HRP标记山羊抗小鼠IgG（二抗）购于北京华美生物制品公司；Olympus光学显微镜为日本Nikon公司产品.

1.2方法细胞稳定转染参照Lipofectamine［4］转染说明书进行，基因转染48 h后，换用含300 mg／L G418的完全培养基筛选. 取待染细胞爬片，固定，滴加30 mL/L H2O2，室温孵育15 min，滴加1∶100稀释的小鼠抗Bcl2 mAb，4℃湿盒中过夜，PBS洗，滴加山羊抗小鼠IgG HRP结合物，37℃，孵育30 min， PBS洗涤，DAB溶液显色5 min，PBS终止反应；自来水充分冲洗，系列乙醇脱水，二甲苯使其透明，中性树胶封片，检测转染细胞中Bcl2蛋白的表达. 转染bcl2的GES1细胞经HE染色进行形态学观察并照相. 另接种细胞于24孔培养板中，每孔接种3×106/L. 每天取3个孔计数，测出每孔中的细胞总数，求出每组平均值，持续计数10 d， 绘制生长曲线. 细胞接种于96孔培养板中，培养24，48，72 h后每孔加入MTT溶液（5 g/L） 20 μL，37℃，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液. 每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶物充分溶解. 选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各A值，记录结果. 空载体质粒pcDNA3转染GES1细胞及正常GES1细胞为对照.

统计学处理:实验结果以x±s表示，用SPSS 11.5软件包进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，两两比较使用Dunnettt检验.

2结果

2.1转染细胞中Bcl2蛋白表达与对照组(GES1和GES1/PcDNA3组)比较，免疫组织化学染色法显示bcl2基因转染细胞均有Bcl2蛋白表达，且明显高于对照组（图1）. 另经HE染色，光镜观察，bcl2基因稳定转染细胞后，细胞形态未见改变.

2.2细胞生长速度绘制生长曲线结果表明bcl2基因转染细胞于第4日后生长速度明显高于对照组（图2）. 培养24，48和72 h转染组细胞的增殖明显增高，经统计学分析，转染组和对照组相比较，有统计学差异（P

3讨论

Bcl2高表达是对各种凋亡刺激的保护，因此Bcl2低表达或缺失的细胞死亡率明显增加. bcl2基因被证明在抑制细胞向凋亡的转变中起重要作用，可以抵抗和抑制多种因素诱导的细胞凋亡，增强细胞的存活力，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控［5-6］. 转染bcl2基因可抑制化疗药物、加热、放射线、细胞生长因子撤销、cmyc或p53基因等多种因素诱导的多种细胞的凋亡，延长细胞生存时间［7-8］. 我们用脂质体介导的基因转染法，将含有人bcl2cDNA的真核表达载体pcDNA3导入人胃上皮细胞系GES1，成功地建立了100％稳定表达Bcl2蛋白的GES1bcl2.

参考文献

［1］ 史朝晖，姜希宏，靳文武，等. 抑凋亡基因bclx L在胰腺癌组织中的表达及意义［J］. 山东医药，2003，43（36）:9-10.

［2］ 夏克栋， 陈向敏， 林巧爱， 等. NFKb、IKb、Bcl2在宫颈癌组织中的表达及其与人乳头瘤病毒感染的关系［J］. 癌症，2005，24（11）:1350-1353.

［3］ 孙梅，张兴义，邹洪杰，等. CyclinD1、Ki67和Bcl2在胃肠道间质瘤的表达及与其预后的关系［J］. 中华胃肠外科杂志，2005，8（6）:542-543.

［4］ 王贤辉， 梁米芳， 李德新， 等. 鼠bclX_L基因在CHO细胞中的表达［J］. 第四军医大学学报，2003，24（24）:2217-2219.

［5］ 李俊峡， 贾国良， 金明， 等. 转染bcl2基因对心肌细胞活力的影响［J］. 第四军医大学学报，2003，24（2）:110-112.

［6］ 王长洪， 陆宇平， 冯新莉， 等. 黄苔胃病患者胃黏膜凋亡基因及相关蛋白的表达［J］. 中国中西医结合消化杂志，2004，12（1）:13-14.

上皮细胞篇5

未明确意义的不典型鳞状上皮细胞(atypicalsquamous cell of undetermined signification，ASCUS)是一种不确定的宫颈细胞学诊断结果，其细胞异常程度比反应性细胞改变显著，但不足以诊断为鳞状上皮内病变，该诊断可重复性差，文献报道20 %的ASCUS有诊断意义。[1]ASCUS的进一步诊断，引起临床妇科医生的关注。本文对宫颈液基细胞学检测为ASCUS的140例病人，采取阴道镜检查和高危型人乳头状瘤病毒(highrisk human papilloma virus，HRHPV)进一步检测宫颈疾病，以进一步明确诊断。

对象与方法

1.对象：2005年1月～2008年1月在克拉玛依市中心医院体检中心体检的9 152例行妇科检查的已婚妇女中，TCT检查中274例液基细胞学诊断异常，其中，140例为ASCUS异常者。140例ASCUS的患者均进行HRHPVDNA检测，并在阴道镜指导下行宫颈活体组织学检查和宫颈锥切，宫颈组织送病理诊断。患者年龄范围23～61岁，平均39岁。有临床症状(白带增多和接触性出血)占 48.54 %(67/140)。

2.宫颈细胞学检查及诊断：采用2001年TBS(the bethesda system)分级系统。宫颈外口和颈管的脱落细胞经 Thinprep 2000系统自动制片机处理后，制成直径2 cm薄层细胞涂片(TCT)、固定、染色。采用2001年国际癌症协会(NCI)推荐的新TBS分类标准分为，未见上皮内病变细胞或恶性细胞(negative for intraepithelial or malignancy，NILM)、其他(子宫内膜细胞出现在40岁以后妇女的涂片)和上皮细胞异常(鳞状上皮异常和腺上皮异常)。鳞状上皮异常分为(1)非典型鳞状细胞。包括非典型鳞状细胞(atypical squamous cell， ASC)、不除外高度鳞状上皮内病变的不典型鳞状细胞(atypical squamous cells ，ASCH )，统称ASCUS;(2)鳞状上皮内瘤变。包括低度鳞状上皮内瘤变(low grade squamouss intraepithelial lesion，LSIL)，高度鳞状上皮内瘤变(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL);(3)鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)。腺上皮异常分为，不明确诊断意义的不典型腺细胞(atypical glandular cell of undetermined significance，AGUS)、腺癌(adenocarcinoma，AC)。ASCUS诊断比例，不超过鳞状上皮内病变的2～3倍，为统一细胞学和组织学诊断术语，LSIL即宫颈上皮内瘤样病变I级(CINI)，HSIL包括CINⅡ和CINIlI或原位癌(CIS)。细胞学阳性诊断是指ASCUS以上病变。

3.阴道镜检查和宫颈活体组织学检查：采用电子阴道镜数字成像系统(深圳中科诺数码科技有限公司的KN2200)，检查由经过专门培训的医师操作，观察宫颈情况，对可疑病灶在镜下活体组织学检查。阴道镜诊断结果，图像名词以1990年第7次世界宫颈病理与阴道镜国际联盟(IFCPC)推荐的名词为主，同一患者宫颈有多种异常图像则取特异性高的图像，如同时有白色上皮、白斑及镶嵌等，则统计时取镶嵌。病理诊断由本院病理科完成。阴道镜宫颈活体组织学检查病理结果分炎症、宫颈上皮内瘤变Ⅰ(cervical intraepithelial neoplasia， CINⅠ)、宫颈上皮内瘤变Ⅱ(cervical intraepithelial neoplasia， CINⅡ)、宫颈上皮内瘤变Ⅲ(cervical intraepithelial neoplasia， CINⅢ)和宫颈癌。

4. HRHPV检测：取宫颈内口和颈管内脱落细胞和分泌物进行二代杂交捕获技术HPVDNA检测(HC2HRHPVDNA)(试剂由成都洋坤科技生物有限公司提供)。检测HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68共13种。取材时将采样刷置于宫颈管内旋转3周，直接将采样刷置于保存液中8 ℃，操作和样品检测参照试剂盒说明书和试剂说明书进行。由新疆自治区人民医院临床实验室完成。HRHPV检测结果判定按照试剂盒说明，相对光读数/临界值(RLU/Cutof)≥1.0的标本为阳性，RLU/Cutof

5.统计学处理：采用SPSS 14.0统计软件，行χ2检验，检验水准a=0.05。

结果

1.宫颈细胞学检查与宫颈活体组织学检查结果比较：宫颈细胞学检查140例ASCUS患者中，宫颈活体组织学检查结果为，CIN(CINⅠ41例、CINⅡ26例、CINⅢ9例、高度鳞状上皮内病变(CINⅡ、CINⅢ)及浸润癌的发生比例分别54.29 %(76/140)、25.00 %(35/140)、2.14 %(3/140)。

2.阴道镜与宫颈活体组织学检查结果比较：宫颈细胞学检查140例ASCUS患者进行阴道镜检查及活体组织检查。阴道镜检查拟诊为CIN的患者(CINⅠ36例，CINⅡ49例CINⅢ 9例)占67.14 %(94/140)， 浸润癌占2.14 %(3/140)。阴道镜检查与活体组织检查诊断符合率为69.28 %(79/140)，阴道镜拟诊CINⅡ以上的符合率为55.73 %(34/61)，拟诊高级别的宫颈上皮内瘤变(CINⅡ、CINⅢ)的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别是85.71 %(30/35)、73.33 %(77/105)、51.72 %(30/58)、83.70 % (77/92)，见表1。表1 140例ASCUS阴道镜检查与宫颈活体组织检查的比较

3. HRHPV阳性比例： HC2HPVDNA阳性比例57.85 %(81/140)，组织学检查为CIN以上患者HC2HPVDNA阳性检出比例为79.75 %(63/79)，阴性为20.25 %(16/79)，HPV阳性率随宫颈病变发展呈增高的趋势，在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌患者的检出率分别为30.64% (18/61)、75.00 %(30/41)、85.41 %(22/26)、90.91 %(8/9)、100.00 %(3/3)，差异有统计学意义(P

讨论

1.宫颈细胞学中ASCUS的临床意义：宫颈细胞学TBS 分类法是由1988 年美国国际癌症协会首先提出的， 该分类法有助于细胞学诊断的准确性。ASCUS 是最常见的一种宫颈细胞学异常， 约占5 %左右[2]。ASCUS 的诊断标准为细胞核增大是正常中层细胞核的2.5～3 .0倍， 核浆比例轻度增大。可能有细胞核形态改变或有双核的情况。核染色质轻度增加， 但仍均匀分布， 无颗粒样改变。细胞核外形通常光滑、规则， 有时可稍不规则。当涂片中异常的细胞仅有1 或2 个， 不足以诊断为HSIL， 这时应该报告诊断为ASCUS， 但不除外HSIL[3]。ASCUS 可能与炎症刺激或制片的方法等有关， 也有可能与CIN 或癌有关。

本研究140例异常的ASCUS中，经活体组织检查确诊CIN的发生比例为76例，占ASCUS的 54.29 %(76/140)，其中CINⅡ和CINⅢ共35例，发生率为25.00 %(35/140)，宫颈癌为3例，发生率为2.14 %(3/140)。宫颈细胞学中ASCUS经宫颈活体组织检查病理后的结果相差很大，且ASCUS可能是CIN的一个信号[4]。因此，对宫颈细胞学为ASCUS的病例，应引起临床妇科医生的关注。

2.阴道镜对宫颈液基细胞学检查异常的意义：阴道镜对ASCUS及其他细胞学异常的诊断是非常重要的。本研究中，CIN以上病变阴道镜检查与病理诊断符合率为69.28.%(79/140)。与文献[4]相差较大。因此，临床上应加大对阴道镜技术的培训外，应该选择客观评分方法如Reid评分避免活体组织检查时漏诊。

3.HPV检测对ASCUS的应用： HPV是小型双链DNA病毒。其感染具有种属特异性，主要引起高级脊椎动物的上皮细胞发生增殖以及乳头瘤样改变。HPV有多种类型，常见的低危型是6，11，42，43，44;常见的高危型是16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，59，68。众多研究发现，HPV高危感染常引起生殖道恶性肿瘤，特别与宫颈癌之间有着密切的联系[5]。本研究采用了二代杂交捕获技术检测宫颈组织中HPV高危型DNA，结果显示，HPV阳性率在CIN和宫颈癌患者中均高于慢性宫颈炎患者，差异有统计学意义(P

对宫颈糜烂或有接触性出血的患者应考虑宫颈细胞学检查结合HPVDNA检查，根据筛查结果进行定向分流，筛查高风险人群，便于进行有效监控，早期发现宫颈癌。如果只有HPVDNA检测结果为阳性，细胞学检查结果阴性，表明尚未引起病变，可暂不予处理，但要随访观察，6～12个月后复查细胞学和HPVDNA检测，如二者均为阴性，可3年后再进行筛查，对于细胞学和HPV检查异常者应积极行阴道镜检查和宫颈活体组织学检查。

【参考文献】

1Stoler MH， Schifman M.Interobserver reproducibility of cervical cytologic and histologic interpretations：realistic estimates from tIle ASCUSLSIL triage study[J].J Am Med Assoc，2001，285(11)：15001505.

2Kurman RJ， Henson DE， Herbst AL， et al. Interim guidelines for management of abnormal cervical cytology [J]. JAMA， 1994， 271 (4) : 1886 1869.

3李克敏， 张岩. 宫颈细胞学ASCUS 临床意义及处理[J]. 中国妇产科临床， 2002， 3(3) : 189 191.

上皮细胞篇6

[关键词] 温敏性水凝胶；细胞外基质；复合支架材料；生物相容性

[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（a）-0026-03

支架材料是组织工程学研究的重要内容之一。理想的组织工程支架材料必须具有良好的生物相容性，而且适合种子细胞在支架上黏附、生长[1]。温度敏感性水凝胶（temperature sensitivity hydrogel，TSH）又被称为温固化水凝胶，当温度超过相变温度时，黏度急剧增高，由液态变为凝胶态[2]。本研究小组在前期已证实经TSH改良的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）所制备的复合支架材料与膀胱平滑肌细胞具有良好的相容性[3]。为给体内研究提供更充足的实验依据，本研究将进一步探索该支架材料与膀胱移行上皮的生物相容性。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

新西兰兔由武汉大学实验动物中心提供；主要试剂有：PEO-PPO-PEO 三嵌段共聚物（购于BASF公司），小鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体（AE1/AE3）（购于Santa Cruz 公司），FITC标记羊抗小鼠单抗隆抗体（购于Abcam公司），磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS），甲醇、丙酮、戊二醛，DMEM F12培养基，Dispase酶，Ⅱ型胶原酶，胎牛血清（fatal bovine serum，FBS），二甲基亚砜（DMSO）、MTT均购于Sigma公司。相差倒置显微镜（日本OLYMPUS），恒温培养箱（日本Napco公司），超净操作工作台（北京半导体设备一厂），扫描电子显微镜（日本SANYO）。

1.2 方法

1.2.1 兔膀胱移行上皮细胞的原代培养及鉴定 选用4周龄新西兰兔，雌雄不限，体重2.0～2.5 kg，空气栓塞处死后，无菌条件下取膀胱前壁组织（2 cm×2 cm），小心分离膀胱黏膜与肌层，将黏膜层组织迅速置入含庆大霉素（20 μg/mL）的PBS中浸泡并漂洗3次。将黏膜组织剪碎成1 mm2大小的组织块，转入新鲜配制的Dispase酶消化液中，于4℃下消化18 h后再用PBS洗涤1次，用不锈钢网滤去组织残块，收集细胞悬液于混合消化液（0.02%EDTA + 0.25%胰酶）中。37℃振荡消化10 min，每2分钟吹打1次，直至成为单细胞悬液，加入FBS终止消化，PBS洗涤3遍，离心8 min（1000 r/min），弃上清，用培养液吹打混匀，再将细胞接种到含10%FBS的DMEM-F12培养基中，置37℃恒温、5%CO2饱和湿度孵箱内常规培养。

将上述培养的细胞传2～4代后接种于盖玻片上再培养2 d，待细胞完全贴壁后，以PBS液冲洗，甲醇、丙酮固定10 min，以小鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体（AE1/AE3）为一抗，以FITC标记羊抗小鼠单抗隆抗体为二抗，孵育、中性树胶封片，于490 nm的蓝色荧光倒置显微镜下观察。以PBS代替一抗作为空白对照。

1.2.2 ECM/TSH复合支架的构建 参考本小组前期研究[3]的方法制备TSH，使用前紫外线照射30 min备用。参照Yang等[4]报道的方法制备ECM，将成品分成32块（1 cm×1 cm），经冷冻干燥后，环氧乙烷消毒，干燥保存于4℃。在低温（4℃）真空环境下，将16块制备的ECM浸入TSH溶液中1 h，取出后经低温冷冻干燥机冻干，分装密封，经环氧乙烷消毒，常温干燥保存备用。

1.2.3 细胞相容性 实验分为四组，每组16孔，A组：ECM/TSH复合支架种植膀胱上皮细胞组；B组：单纯ECM种植膀胱上皮细胞组；C组：单纯培养膀胱上皮细胞组；D组：无细胞培养液组。种植细胞前先用培养液将支架材料预湿，取第3代膀胱上皮细胞悬液（浓度1×105/mL）50 L缓慢接种于材料上，4 h后再加入DMEM F12培养基（含FBS），置37℃恒温、5%CO2饱和湿度孵箱内培养，2 d后换液，倒置相差显微镜下观察细胞黏附、生长情况。

1.2.4 膀胱上皮细胞生长情况扫描电镜观察 膀胱上皮细胞与支架材料复合培养48 h后，A、B组各取一块材料/细胞复合物，经过PBS漂洗3次，3%戊二醛、2%的四氧化锇双重固定、脱水、醋酸异戊酯置换、干燥、喷金， 扫描电镜观察。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 原代培养细胞形态

细胞接种时呈圆形，大小均一，轮廓清晰，胞浆透亮。接种24 h后，可见细胞贴壁生长，细胞密集生长区域可见细胞伸展后相互连接呈簇状，呈散在的簇片状分布，细胞间连接紧密，形态呈典型的“铺路石样”表现，符合上皮细胞特征。3 d后细胞进入对数生长期，7 d可连接成片，长满整个培养瓶底部。

2.2 组织学检查

2.2.1 种植细胞前后的复合支架材料 倒置相差显微镜下观察：ECM为网状结构，HE染色后可见红染的胶原纤维规则排布，纤维较细，网孔较大，未见到细胞碎片；复合TSH后胶原直径变粗，网孔孔径变小。种植膀胱上皮细胞后4 h，光镜下可见细胞紧密黏附于材料表面，少数散落到培养瓶底贴壁生长。加入培养基10 h，可见细胞已伸展，有多个突起。培养3 d时，黏附于材料的细胞数量增加，细胞增殖明显。

3 讨论

组织工程学是综合应用工程学和细胞生物学的原理，将体外培养扩增后的种子细胞与可降解的生物支架材料相复合，再将其回植体内缺损部位，从而再生成具有正常结构和功能的组织，达到真正意义上的生物学修复[5-6]。材料的生物相容性检测是该领域不可缺少的重要组成部分，理想的组织工程支架材料应当具有良好的细胞相容性、能够促进细胞增殖和组织形态的形成，为此本小组做了系列研究[7-8]。

与笔者前期研究结果相似，本实验中ECM/TSH复合材料比单纯ECM，纤维直径变粗，网孔孔径变小，与接种细胞的接触面积增大。经TSH修饰以后的ECM对细胞表现出更强的黏附性，为细胞的附着、生长、增殖提供了良好的微环境。超微结构观察显示，植入的膀胱上皮细胞能够紧密地附着于ECM胶原纤维之上，细胞之间形成紧密联结，周围可观察到ECM的分泌。MTT检测结果表明膀胱上皮细胞易于在ECM/TSH复合支架材料上生长，增殖情况较好，符合膀胱黏膜上皮细胞的生长规律，细胞未见凋亡和分化，实验结果提示ECM/TSH复合支架材料与膀胱黏膜上皮细胞具有良好的生物相容性，为下一步应用于体内研究提供了实验依据。

[参考文献]

[1] Feng C， Xu YM， Fu Q， et al. Evaluation of the biocompatibility and mechanical properties of naturally derived and synthetic scaffolds for urethral reconstruction [J]. J Biomed Mater Res A，2010，94（1）： 317-325.

[2] Chiappetta DA， Sosnik A. Poly （ethylene oxide）-poly （propylene oxide） block copolymer micelles as drug delivery agents： improved hydrosolubility， stability and bioavailability ofdrugs [J]. Eur J Pharm Biopharm，2007，66（3）： 303-317.

[3] Yao Y， Yang SX， Zhang C， et al. Biocompatibility of compounds of extracellular matrix and thermally reversible hydrogel [J]. Journal of Wuhan University of Technology Material Science Edition，2007，22（3）：439-442.

[4] Yang SX， Yao Y， Hu YF， et al. Reconstruction of rabbit urethra using urethral extracellular matrix [J]. Chin Med J （Engl），2004，117（12）： 1786-1790.

[5] Engelhardt EM， Micol LA， Houis S， et al. A collagen-poly （lactic acid-co-varepsilon-caprolactone） hybrid scaffold for bladder tissue regeneration [J]. Biomaterials，2011，32（16）：3969-3976.

[6] Falke G， Caffaratti J， Atala A. Tissue engineering of the bladder [J]. World J Urol，2000，18（1）：36-43.

[7] Yang SX， Shen FJ， Hu YF， et al. Experimental bladder defect in rabbit repaired with homologous bladderextracellular matrix graft [J]. Chin Med J （Engl），2005，118（11）：957-960.

上皮细胞篇7

【摘要】 目的：探讨大鼠肾小管上皮细胞的体外培养及鉴定方法，为肾结石病的研究提供实验平台。方法：采用机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法分离出肾小管节段，在含10%胎牛血清和1%上皮细胞生长因子的上皮细胞培养基中培养，0.25%胰蛋白酶消化后传代培养，并用原代和传1代细胞做免疫细胞化学染色鉴定。结果：细胞培养至第3天完全贴壁，4～7 d处于对数生长期，为多边鹅卵石样;免疫细胞化学染色显示cytokeratin 18表达阳性。结论:机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法结合使用上皮细胞培养基可以培养得到较纯的肾小管，是大鼠肾小管上皮细胞原代培养的理想方法，为进一步研究泌尿系结石病因和机制提供了实验基础。

【关键词】 肾小管上皮细胞; 原代培养; CK18; 大鼠

[Abstract] Objective： To discuss the method of the primary culture and identification of SD rats renal tubular epithelial cells， thus to supply an experimental platform for the study of renal calculi.Methods： The renal tubular segments were isolated by mechanical grinding and collagenase Ⅰdigestion. The collected cells were cultured with EpiCM，which contained 10% FBS and 1% EpicGs， in incubation with 5% CO2 at 37 ℃， and subcultured with 0.25% trypsin.The cultured cells were identified by immunocytochemistry. Results: The cultured cells were completely adhered after 3 days， the logarithmic growth phase was beween 4 and 7 days. The cells were large， displaying the typical cobblestone appearance.Immunocytochemistry suggested that the expressions of cytokeratin 18 in renal tubular epithelial cells were positive. Conclusion: Mechanical grinding and collagenase Ⅰdigestion combined with EpiCM is an ideal method to collect and culture the renal tubular epithelial cells，and it provides the experimental basis for further study of the etiology and mechanism of urinary tract stones.

[Key words] renal tubular epithelial cells; primary culture; CK18; rats

尿石症是泌尿外科最常见的疾病之一，主要病因包括遗传、环境、饮食、代谢等。一般认为，它的形成是一系列化学的、生化的、生理的及分子调节等因素综合作用的结果[1]，其早期病变是微小晶体黏附在肾小管上皮细胞表面并引起损伤。可见，肾小管上皮细胞可以作为进一步研究尿石症病因及发病机制的一个实验平台。目前，国外已建立部分种属的肾小管上皮细胞株，但价格昂贵且不易获得。本实验旨在探讨一种理想的肾小管上皮细胞原代培养方法。

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物：SD大鼠2只，一雄一雌，体重分别为220 g和200 g，由广州中医药大学动物实验中心提供[许可证号为SCXK(粤)20080020粤监证字2008A002]。主要试剂：胎牛血清(Gibco公司)、上皮细胞培养基EpiCM(美国ScienCell公司)、Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、青/链霉素(Sigma公司)、cytokeratin 18一抗(美国Santa Cruz公司)、山羊抗小鼠二抗(北京博奥森公司)、上皮细胞生长因子EpicGs(美国ScienCell公司)、PV9005小鼠超敏二步法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥)、ZLI9017浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥)。主要仪器：80和100目不锈钢筛网(广州普博生物公司)、XDS1B型倒置相差显微镜(日本Olympus公司)、荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)、CO2细胞培养箱(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 肾小管节段的分离提取 大鼠实验前禁食12 h，水摄入不限。颈椎脱臼后于70%酒精中浸泡2～3 min后取出，在超净台上无菌取下两侧肾脏。在盛有PBS培养皿中去除肾蒂和包膜，剪碎肾皮质至约1 mm3大小(冰上操作)，PBS反复冲洗3遍去除血质后转移到80目筛网上，研磨并以PBS充分冲洗，网下液体倒至100目筛网上，收集网上物于培养皿中，反复吹打转至15 ml离心管，1 200转·min-1离心10 min。

1.2.2 肾小管节段的消化和肾小管上皮细胞的原代培养 离心后弃上清，加入1 mg·ml-1的Ⅰ型胶原酶2 ml，0.1 mg·ml-1的DNase 0.1 ml，充分混匀，37 ℃水浴震荡消化约30 min，加入不含血清的EpiCM 2 ml终止消化，混匀，1 600转·min-1离心6 min，弃去上清，加入4 ml含10%胎牛血清、1%上皮细胞生长因子、1%双抗的上皮细胞培养基EpiCM，吸管充分轻轻混匀后移入25 cm2培养瓶中，在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。

1.2.3 肾小管上皮细胞的传代培养 原代培养至第3天首次换液，以后每两天换1次，至第6天细胞基本铺满整个瓶底，吸去瓶内全部培养液，用PBS洗涤3次，分两组进行消化，各滴加0.25%胰蛋白酶(A组)、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA复合液(B组)1.5～2.0 ml(以刚好能全部覆盖瓶底细胞为标准)，37 ℃消化1～2 min，镜下见约85%细胞收缩、变圆，少许脱落，此时立即加入双倍的含10%胎牛血清、1%上皮细胞生长因子、1%双抗的上皮细胞培养基EpiCM，用吸管顺瓶底轻轻吹打使细胞完全脱落、充分混匀，细胞计数后以1∶2的比例传代培养。

1.2.4 肾小管上皮细胞的鉴定 形态学：倒置显微镜下观察细胞体积较大，呈多边鹅卵石样，透明度和折光性较强，各细胞紧密相连。免疫细胞化学：将传1代的肾小管上皮细胞接种于装有盖玻片(经泡酸、灭菌处理)的24孔细胞培养板中，待细胞约长满时取出盖玻片。PBS冲洗2次，4%冷多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗2次后加3% H2O2去离子水孵育10 min阻断内源性过氧化物酶，cytokeratin 18一抗(1∶400)4 ℃过夜(阴性对照用PBS替代一抗)，二抗(即用型)37 ℃孵育1.5 h，再DAB显色、自来水冲洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。普通光学显微镜下观察结果。

2 结 果

刚提取的肾小管节段如图1所示。原代培养的肾小管上皮细胞12 h左右即有贴壁，24～36 h后可见上皮样细胞从贴壁的节段外周爬出，使得此时整个培养瓶底的细胞呈“岛屿状”(图2)，培养第3天后首次换液。第4～7天是对数生长期，约6～7 d基本长满瓶底(图3)。镜下观察细胞体积较大，呈多边鹅卵石样，透明度和折光性较强。传代细胞A组第2天贴壁，第5～6天呈指数性生长，形态多为短梭形，少数呈多边形鹅卵石样;B组3 d后少量细胞贴壁，形态不一，细胞连接不紧密，折光性较差，至第7天左右细胞全部漂浮、死亡。免疫细胞化学染色检测肾小管上皮细胞特异性表达的cytokeratin 18，在镜下可见肾小管上皮细胞的胞核周围及胞质内有不均匀分布的棕褐色颗粒(图4、5)，而阴性对照组未见到(图6)，证明培养的是肾小管上皮细胞。

3 讨 论

尽管关于泌尿系结石的形成机制在国内外已有不少研究，但仍存在一些未曾阐明的问题。目前已有多种学说，如肾钙斑学说、过饱和结晶学说、基质学说等[2]。总而言之，肾结石的形成是一个多因素参与的过程，包括尿液的过饱和、微小晶体的形成及结晶的生长和成熟等。其中，微小晶体黏附于肾小管上皮细胞表面并引起损害被认为是肾结石形成过程中关键的一个环节[3-4]。由此可见，利用体外培养的肾小管细胞作为一个实验平台，可以更进一步研究阐述泌尿系结石的形成机制。

目前，国内外已建立了猪、兔、大鼠和人等多种不同种属的肾小管上皮细胞株，虽然可以在短时间内获得数量足够的细胞，但价格昂贵且不易获得。况且，在反复传代过程中细胞株会丧失某些功能甚至发生转分化等[5]，不能完全代表其正常的生理状况，且可能还具一些致瘤性[6]，因此不适合研究的需要。肾小管上皮细胞的培养方法除应用细胞株培养外，还有另外两种方法。其一是先分离筛选出肾小管节段，然后进行培养;其二是van Kooten等报道的通过选择性培养基促进上皮细胞的生长，同时抑制其他细胞的生长[7]。虽然原代培养技术要求高、传代次数有限，但它更接近生理状况，细胞的变化相对稳定，既没有损伤也没有严格的研究时间限制[8]。目前，国内外有报道用Percoll密度梯度离心法分离肾小管细胞，Percoll为一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，它具有不穿透生物膜，对细胞无毒害的作用，其密度为1.130 g·ml-1，可根据活细胞、接近死亡的细胞以及细胞碎片密度不同而将其分离开，以获得活性较好的细胞[5，9-10]。但是，用此法大大增加了细胞提取的操作时间，也会影响细胞的活性，另外Percoll密度梯度离心法所获得的肾小管节段数量少。Mattila等报道，采用研磨、筛网过滤的方法能达到分离肾小管节段和肾小球的目的[11]。本研究应用80目和100目孔径的不锈钢筛网分离肾小管，可以排除肾小球上皮细胞的混杂，肾小管细胞的纯度可达到90%以上，且与Percoll密度梯度离心法相比，研磨消化法获得的细胞数量较多。对于肾小管上皮细胞的消化，国内报道多采用胰蛋白酶，但是浓度难以确定，过高(>0.25%)会影响细胞贴壁和生长，甚至无法传代;过低又不能很好地消化细胞[12-13]。用1 g·L-1的Ⅰ型胶原酶消化20～30 min效果佳，培养的细胞贴壁率高，长势良好。在原代培养中，本实验应用上皮细胞培养基和上皮细胞生长因子，可以使成纤维细胞和其他一些杂细胞的增殖大部分甚至完全被抑制，从而有利于上皮细胞的生长，得到的细胞纯度高[7，14]。在原代细胞生长至第6天传代培养时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代后的细胞贴壁和生长情况良好;而用0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA复合液消化，肾小管细胞贴壁需要时间长且数量少，无法继续生长，原因可能是肾小管上皮细胞对EDTA敏感，EDTA对其有抑制性。

上皮细胞中间纤维结构中含有角蛋白成分，是上皮细胞的特异性标志。肾小管上皮细胞主要表达cytokeratin 18[15]，尽管有报道肾小球足细胞、球囊上皮细胞也有角蛋白表达(未明确是否为18型)，但使用研磨、分离方法已将肾小管和肾小球细胞分离纯化，故不会对实验造成影响。本实验采用原代和传一代的细胞进行免疫细胞化学染色，选择cytokeratin18一抗(浓度为1∶400)进行特异性鉴定。镜下均发现细胞质和细胞核周围有棕褐色不均匀散在分布、强度不一的阳性颗粒，再结合上皮细胞的镜下特点(典型的多边鹅卵石状，细胞间相连紧密)，证实培养的细胞是肾小管上皮细胞。

肾小管上皮细胞的原代培养较难，各方面要求较高，通过多次培养，在实验过程中我们体会到以下几点的重要性：(1) 肾小管节段的获取必须严格无菌。(2) 肾小管细胞的消化尽量选用Ⅰ型胶原酶，效果佳。对于使用胰蛋白酶，没有明确的推荐浓度。国内王东等提出胰蛋白酶的浓度为0.2%～0.25%时对肾小管细胞消化较好[12]。而廖晓星等报道0.2%以上的浓度将明显影响肾小管细胞的贴壁和生长，并建议以0.15%为宜[13]。(3) 在分离培养后的前3 d内，由于组织块粘贴不牢，尽量不要移动培养瓶。(4) 72 h后首次换液，若细胞贴壁不理想可以半换液，但在操作中注意动作轻巧，避免因液体震荡对细胞的冲击引起其漂浮。以后依据细胞生长情况及时换液，一般每两天1次，否则漂浮物会对细胞有毒性作用。(5) 使用一次性塑料培养瓶的肾小管细胞贴壁所需时间比用玻璃培养瓶短，且生长更好。

本实验证明，采用机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法分离肾小管节段，结合使用含EpicGs的上皮细胞培养基原代培养肾小管上皮细胞是一种理想的方法，为进一步研究泌尿系结石的病因及机制奠定了实验基础。

参考文献

[1] BIGELOW M W， WIESSNER J H， KLEINMAN J K， et al. Calcium oxalate crystal attachment to cultured kidney epithelial cell lines[J]. J Urol，1998，160:15281532.

[2] 叶章群，邓耀良，董诚.泌尿系结石[M].北京:人民卫生出版社，2003:102105.

[3] BIGELOW M G， JOHN H， WIESSNERNEIL S， et al. Calcium oxalatecrystal membrane interactions:dependence on membrane lipidcomposition[J]. J Urol，1996，155:10941018.

[4] LIESKE J C， TOBACK F G. Regulation of renal epithelial cell endocytosis of calcium oxalate monohydrate crystals [J].Am J Physiol，1993，264：F800F808.

[5] 毛慧娟，王笑云，徐昌芬，等. 人肾近端小管上皮细胞的原代培养、传代及鉴定方法研究[J].南京医科大学学报，2004，24(6):561564.

[6] 严玉澄，钱家麒，戴慧莉，等.人近端小管上皮细胞的原代培养[J].上海第二医科大学学报，2005，24(4):388391.

[7] van KOOTEN C， LAM S， DAHA M R， et al. Isolation， culture， characterization and use of human renal tubular epithelial cells[J]. J Nephrol，2001，14:204210.

[8] RYAN M J， JOHSON G， KIEK J， et al. HK22: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney[J].Kidney Int，1994，45:4857.

[9] SUTTERLIN G G， LAVERTY G. Characterization of a primary cell culture model of the avian renal proximal tubule[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，1998， 275(1):R220R226.

[10] 刘晓玲，邢淑华.Percoll法分离培养肾小管上皮细胞[J].徐州医学院学报，2006，26(2):100103.

[11] MATTILA P M， NIETOSVAARA Y A， USTINOV J K， et al. Antigen expression in different parenchymal cell types of rat kidney and heart[J]. Kid Int，1989，36(2):228233.

[12] 王东，吴雄飞，金锡御.大鼠肾小管上皮细胞的原代培养及传代[J].中华实验外科杂志，1999，(16):179180.

[13] 廖晓星，唐洪林，孙庭，等. 肾小管上皮细胞原代培养及鉴定[J].中国现代医药杂志， 2004，(6):1214.

上皮细胞篇8

关键词：肌上皮细胞 涎腺疾病 肿瘤

【中图分类号】R-0 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）04-0037-02

肌上皮细胞（Myoepithelial cell，MEC）作为涎腺的一种重要组织成分，1897年由Renault首先命名[1]，它具备上皮细胞和间叶细胞双重形态，具有收缩特性，可以协助导管排出分泌物。目前已经证实MEC可以表达和蓄积大量的肿瘤抑制因子、分泌生长因子和细胞因子[2]。随着研究的发展，因其可能具备抵抗腺体萎缩和抑制肿瘤[3]等特性，近年来受到医疗科研人员的广泛关注。

1 肌上皮细胞的结构和功能

MEC广泛分布于人的涎腺、乳腺、前列腺等多种正常组织，它位于腺泡和小导管的腺上皮与基膜之间，形态扁平状，发出数个分支突起，该突起呈放射状包绕在腺泡表面，形似篮子，故又名篮细胞（basketcell）。腺泡及闰管的外表面公认有MEC的存在，但纹管外周是否有MEC分布存在争议。Chaudhry[4]等认为人类腮腺的肌上皮细胞不像其他物种仅局限于腺泡闰管系统，而是扩展到了小叶内外的纹状管。纹管内的肌上皮细胞小而少，并且形状各异，但是对于腺泡闰管系统而言它们之间的关系和超微形态结构均是相似的。

Garrett[5]等学者采用结构和功能研究的证据表明MEC通常受交感神经和副交感神经的双重支配作用，这两种神经发出的冲动都可以引起MEC收缩。他们使用“唾液流动”和“腔内压力变化”的功能性评估来确定肌上皮细胞收缩的作用，并证实涎腺MEC具有以下功能：①加快唾液的流出；②减少管腔体积；③有助于施加分泌压力；④克服外周阻力促进唾液流动；⑤支持表面软组织；⑥某些情况下帮助排出实质细胞内容物等。

Elewa[6]采用透射电镜在超微结构下观察到MEC凸出在基底层或贴近于实质细胞的表面，并且能分泌一种浆液性颗粒，而MEC的细胞结构特征与这种颗粒及其采用顶浆分泌的方式有关系。成熟的MEC则不会出现在局部分泌的实质细胞表面，而是凸出于基底层，通过顶浆分泌来发挥自己的功能。但是否有其他因素，导致不同外分泌腺的MEC之间存在形态学差异还有待进一步的研究。

2 肌上皮细胞的生物学研究

早在1965年，巴尔卡就已经证明了涎腺中腺泡和导管细胞的增殖能力。许多后来的研究证实了这一发现[7-9]，而作为涎腺的一种重要细胞组成成分MEC最初被理解为不能增殖分裂的终末分化细胞状态。Smith[10]等通过超微结构和细胞动力学研究表明肌上皮可能来自于基底透明细胞，认为其本身是最终分化的细胞。Joshi[11] 确认上皮增生区域内的细胞具有同时分化为上皮和肌上皮的可能性。涎腺肿瘤方面有猜测认为涎腺肿瘤包括肌上皮瘤（myoepithelioma）、多形性腺瘤（pleomorphic adenoma）、腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma）的组织学差异与肌上皮细胞参与有关，而MEC自身是否通过增殖继而引发涎腺肿瘤存在争议。

Batsakis[12]推测MEC具有极低的增殖速率，甚至考虑它可能不存在有丝分裂。Johns[13]曾试图从克隆化的多形性腺瘤细胞中寻找成熟的MEC，结果是失败的。Burgess[14]等将大鼠腮腺导管结扎后诱导腺体发生渐进性萎缩，为了更好的对增殖的肌上皮细胞进行计数，他采用了免疫组织化学双重染色技术，利用增殖细胞核抗原（PCNA）抗体和特异性肌动蛋白（HHF-35）观察导管结扎后腮腺中肌上皮细胞的变化规律。发现在正常大鼠腮腺MEC增殖速率较低，约为1.6%±0.73%，但导管阻塞后发生快速增殖，在腮腺导管阻塞后第5天达到峰值，达到23%，之后增殖速率逐渐下降，第10天以后增殖率均已低于5%。他认为，在正常情况下腺体中的肌上皮细胞低增殖率，腺体受到损伤时其增值速率加快。由此得出结论：在正常涎腺中MEC可以通过有丝分裂增殖，而不是原来那样被认为是无丝分裂。它通过缓慢的增殖来进行细胞更替，从而维持正常腺体的稳定状态。MEC可以被认为是一种潜能的快速变化的祖细胞。

Takahashi[15]等在2005年同样采用肌动蛋白和PCNA（增殖细胞核抗原）做免疫组化双染标记，并采用TEM（透射电镜）对大鼠萎缩舌下腺中的MEC进行了生物学行为的观察，他使用特制的金属导管夹将舌下腺导管阻塞，诱导腺体萎缩，一周后去除金属夹促使腺体再生。免疫组化和TEM结果表明，肌上皮细胞发生了显著增殖，并且在第7天达到增殖高峰，形态表现为不规则的褶皱和外形突起，呈异形性，围绕在残留萎缩腺体的管道和再生腺体腺泡中。这一外观与之前报道[16-18]的其他萎缩涎腺中的MEC外形相似。

MEC在增殖后发生了一定程度的数量与分布变化。正常成熟腮腺内MEC呈星网状环绕在闰管表面，除腺泡表面可看到MEC发出的少量突触外，几乎看不到MEC[19]。Karen Burgess [20]通过免疫组化并结合形态计量学分析对唾液腺萎缩和再生过程中肌上皮细胞的数量和位置变化做了统计。形态学分析表明，随着腺体的萎缩，肌上皮细胞的面积相对的增加（如闰管、纹状管区域）。在萎缩的第7天，MEC占总数肌上皮区域的百分比由静止期腺体内的2.7%上升到19%。之后导管结扎再通后第一天腺泡细胞再生非常明显。再生期第14天肌上皮细胞面积占总肌上皮区域下降到4.3%；形态学和组织学结果表明，腮腺在经过7天萎缩以及14天再生之后能够恢复到原来基本的解剖学状态。但每种类型的细胞应对萎缩和再生的方式有所不同。Takahashi[21]同样认为MEC分布位置发生了变化，从腺泡边缘处迁移到导管与腺泡的交界部位。

赵腾达[22]等在2012年通过结扎大鼠一侧腮腺导管制作了不同时间点的腮腺萎缩模型，定量分析了MEC在腮腺萎缩不同时间点的数量及分布情况。他观察到导管结扎后5 d内，MEC反应性大量增殖，随后数量增长略缓慢，伴随腮腺的逐渐萎缩，100天后细胞数量快速减少。且在腮腺萎缩早期，MEC位于腺泡及闰管表面，呈星形或梭形，随着腺体的萎缩，最终呈梭形分布于导管样结构的外层。他推论：MEC自身增殖以及对导管阻塞的抵抗效应是引起数量增多的重要因素。唾液腺萎缩晚期MEC所环绕的大导管的扩张，除考虑小导管融合外，还应该与对腮腺的萎缩抑制效应有关。

3 肌上皮细胞抵抗涎腺萎缩

如果将萎缩的涎腺组织制成病理切片放在光镜下观察：显著的特点就是腺泡细胞结构的丧失和导管细胞的增加，但在不同腺体，腺泡消失的方式各有不同。Takahashi[23，24]认为在唾液腺内增殖活性差异可能是导致腺泡消失方式不同的一个主要因素。Burgess[14] 的研究认为MEC在正常腺体中增殖速度较低，但是在腺体受到损害及萎缩状态下增殖活性增高，并且可以一定程度上抑制涎腺的萎缩，Takahashi，Kohgo[25]等在大鼠涎腺的萎缩期发现了增殖高峰。他们认为相比腺泡等其他结构，MEC具有更强的抗萎缩能力。一部分MEC在导管开始萎缩时消失，但激发了显著数量的MEC更快的进入一个新的细胞循环周期中。Emmelin[26]将猫的腮腺导管结扎后，应用超微结构的观察：发现伴随分泌的减少腺泡逐渐萎缩，但MEC仍在持续工作，未出现功能的丧失，结构上却发生了异常变化，特别是在潜在的腺泡萎缩区域，它的基底膜有显著增厚的现象。Cotroneo [27]等学者通过形态学观察则认为星网状的肌上皮细胞围绕于萎缩涎腺的腺泡表面是一种腺体功能恢复的早期特征。

4 肌上皮细胞的抑癌作用

肌上皮细胞存在于涎腺肿瘤，但却并不是活跃的和必须的组成成分。肿瘤性肌上皮细胞形态学变异大，在肿瘤中MEC常分化不完全，多数情况下，MEC经常以前体细胞或管腔上皮与非管腔上皮的过渡形式存在[28]。已经有资料表明，有肌上皮细胞参与的涎腺癌转移性较低，而且癌症的进展程度也较无肌上皮细胞参与的缓慢[29]。临床与实验研究均证实，在转移性强侵袭性强的肿瘤，相关的基底膜逐渐降解，肌上皮细胞结构特征消失，涎腺导管系统来源的高度恶性癌中缺乏肌上皮细胞而良性肿瘤内则含有肌上皮细胞[30]。

Miguita[31] 等人认为肌上皮细胞在唾液腺肿瘤的发生发展中发挥了重要作用，它使得这些肿瘤的侵蚀性降低。他们对多形性腺瘤中的FGF-2（成纤维细胞生长因子-2），TGFβ- 1（转化生长因子β -1），PDGF -A（血小板衍生生长因子-A）和它们各自的受体等进行了MEC的体内体外实验。研究表明FGF-2在良性多形性腺瘤MEC内发挥重要作用，有助于MEC通过FGFR-1来进行增殖。目前，MEC在抑制肿瘤方面的作用已证实有以下机制[32]：①合成和改建基底膜，抗基膜降解；②旁分泌诱导上皮形成，分泌细胞因子与生长因子；③抑制微小血管生成；④产生和表达大量的肿瘤抑制剂和蛋白酶抑制剂，干扰肿瘤细胞的侵袭，分泌高水平的maspin（一种抑癌因子）。

5 肌上皮细胞的标记物

5.1 maspin。目前的超微结构和免疫组化研究均显示MEC分泌高水平的maspin，及其它抗浸润的蛋白酶抑制剂。maspin的主要产物是丝氨酸蛋白酶抑制剂，在细胞迁徙和增殖中起重要作用，并能够抑制肿瘤的发生、发展。它们在MEC 基质中积累聚集，阻止体外癌细胞向基质内浸润。maspin高表达于MEC中，而在导管上皮中无表达[33]则说明：MEC是一种天然的抑癌细胞。

5.2 -SMA。特异性平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin）是一种传统的MEC标记物，它在临床与实验中应用较为成熟、广泛。因MEC具有平滑肌样结构内含肌动蛋白，所以采用-SMA抗体可以将其准确标记。国外学者在研究MEC在涎腺内增殖或萎缩特性时经常将其与相关抗体联合，免疫组化双重染色，取得了良好的效果。但该种标记物的缺点是可在血管平滑肌细胞及间质肌纤维母细胞中表达，而涎腺肿瘤经常伴有血管增生，所以在一定程度上增加了诊断难度。

5.3 CD109。CD109是一种糖基化磷脂酰肌醇联接的糖蛋白，它是含硫脂的α2巨球蛋白家族的一员，表达在造血细胞的一个亚群、内皮细胞以及多种人类肿瘤当中[34]。相对于其他类型的肺癌，如腺癌、大细胞癌和小细胞，CD109蛋白优先表达于肺鳞癌细胞内。Hasegawa[35]等人发现CD109高表达于乳腺、泪腺、唾液腺的MEC以及前列腺基底细胞，观察在切片中CD109抗体强染色于肌上皮细胞和基底细胞，但在导管，腺泡等分泌细胞着色较少，且在检查乳腺导管癌和前列腺腺癌时呈现阴性。他认为CD109是浸润性乳腺癌和前列腺癌诊断的参考指标之一。在临床与实验研究中，我们可以将CD109作为一种新型的MEC标记物来应用。

5.4 Calponin。Calponin是一种由钙调素、肌动蛋白和原肌球蛋白组成的复合物，参与调节平滑肌细胞的收缩过程。目前研究发现Calponin用于鉴别肿瘤性MEC非常敏感，可表达于各种MEC分化肿瘤细胞，但由于它和肌纤维母细胞会发生交叉反应，故联合应用Calponin和不与肌纤维母细胞反应的CK14可以提高诊断的正确率。

6 问题与展望

近年来，伴随着生活水平的提高，涎腺疾病患者对涎腺功能恢复的要求也在逐渐增加。如何保护人民健康，改善涎腺疾病患者的生活质量，成为口腔颌面外科专业关注的热点。医疗工作者已观察到MEC对于涎腺疾病的发生、发展和预后具有积极的效果，以及其在抑制涎腺肿瘤的重要价值。但目前它在腺体萎缩及肿瘤中的具体作用机制仍有待于进一步研究。相信随着对MEC的逐渐了解和深入，我们将会获得更为有效的治疗方法。

参考文献

[1] Palmer R M.The identification of myoepithelial cells in human salivary glands.A review and comparison of light microscopical methods[J].Journal of Oral Pathology & Medicine，1986，15（4）：221-229

[2] 朱晓杰.张佳莉 陈新明，涎腺肿瘤中的肌上皮细胞标志物[J].国际口腔医学杂志 ISTIC，2012，39（1）

[3] Sternlieht MD，Kedeshian P，Shao ZM，et a1.The human myoepithelial ceil is a natural tumor suppressor[J].Clin Cancer Res，1997，3（11）：1949-1958.

[4] Chaudhry A P，Cutler L S，Yamane G M，et al.Ultrastructure of normal human parotid gland with special emphasis on myoepithelial distribution[J].Journal of anatomy，1987，152：1

[5] Garrett J R，Emmelin N.Activities of salivary myoepithelial cells：a review[J].Medical biology，1979，57（1）：1-28

[6] Elewa YH，Bareedy MH，Abuel-Atta AA et al.Cytoarchitectural differences of myoepithelial cells among goat major salivary glands[J].Vet Res Commun.2010；34（6）：557-67

[7] Dardick I，Burford-Mason A P.Current status of histogenetic and morphogenetic concepts of salivary gland tumorigenesis[J].Critical Reviews in Oral Biology & Medicine，1993，4（5）：639-677

[8] Barka T.Induced cell proliferation：the effect of isoproterenol[J].Experimental cell research，1965，37（3）：662-679

[9] Denny P C，Chai Y，Klauser D K，et al.Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations inmale mouse submandibular gland[J].The Anatomical Record，1993，235（3）：475-485

[10] Smith C A，Monaghan P，Neville A M.Basal clear cells of the normal human breast[J].Virchows Archiv A，1984，402（3）：319-329

[11] Joshi K，Smith J A，Perusinghe N，et al.Cell proliferation in the human mammary epithelium.Differential contribution by epithelial and myoepithelial cells[J].The American journal of pathology，1986，124（2）：199

[12] Batsakis J G，Regezi J A，Luna M A，et al.Histogenesis of salivary gland neoplasms：a postulate with prognostic implications[J].The Journal of Laryngology & Otology，1989，103（10）：939-944

[13] Johns M E，Mills S E，Thompson K K.Colony-Forming Assay of Human Salivary Gland Tumors：Applications for Chemosensitivity and Histogenetic Studies[J].Archives of Otolaryngology，1983，109（11）：709-714

[14] Burgess KL，Dardick I，Cummins MM.Myoepithelial cells actively proliferate during atrophy of rat parotid gland[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.1996，82（6）：674-80

[15] Takahashi S，Kohgo T，Nakamura S，et al.Biological behavior of myoepithelial cells in the regeneration of rat atrophied sublingual glands following release from duct ligation[J].Journal of molecular histology，2005，36（5）：373-379

[16] Emmelin N，Garrett J R，Ohlin P.Secretory activity and the myoepithelial cells of salivary glands after duct ligation in cats[J].Archives of oral biology，1974，19（4）：275-283

[17] Garrett J R，Emmelin N.Activities of salivary myoepithelial cells：a review[J].Medical biology，1979，57（1）：1-28

[18] Harrison J D，Badir M S.Chronic submandibular sialadenitis：ultrastructure and phosphatase histochemistry[J].Ultrastructural pathology，1998，22（6）：431-437

[19] Redman RS.Myoepithelium of salivary glands[J].Microsc Res Tech.1994，27（1）：25-45

[20] Karen Burgess L，Dardick I.Cell population changes during atrophy and regeneration of rat parotid gland[J].Oral Surgery，Oral Medicine，Oral Pathology，Oral Radiology，and Endodontology，1998，85（6）：699-706

[21] Takahashi S，Nakamura S，Suzuki R.Changing myoepithelial cell distribution during regeneration of rat parotid glands[J].Int J Exp Pathol.1999，80（5）：283-90

[22] 赵腾达，左金华，王丽芳，等.肌上皮细胞在大鼠腮腺萎缩过程中的转归[J].华西口腔医学杂志，2013，31（1）

[23] Takahashi S，Shinzato K，Domon T，et al.Proliferation and distribution of myoepithelial cell during atrothy of the rat sublingual gland[J].J Oral Pathol Med.2003，32（2）：90-4

[24] Takahashi S，Kohgo T，Nakamura S，et al.Biological behavior of myoepithelial cells in the regeneration of rat atrophied sublingual glands following release from duct ligation[J].J Mol Histol.2005 Jun；36（5）：373-9

[25] Takahashi S，Kohgo T，Nakamura S，et al.Biological behavior of myoepithelial cells in the regeneration of rat atrophied sublingual glands following release from duct ligation[J].Journal of molecular histology，2005，36（5）：373-379

[26] Emmelin N，Garrett J R，Ohlin P.Secretory activity and the myoepithelial cells of salivary glands after duct ligation in cats[J].Archives of oral biology，1974，19（4）：275-283

[27] Cotroneo E，Proctor GB，Paterson KL，et al.Early markers of regeneration following ductal ligation in rat submandibular gland[J].Cell Tissue Res.2008，332（2）：227-35

[28] de Araújo V C，Altemani A，Furuse C，et al.Immunoprofile of reactive salivary myoepithelial cells in intraductal areas of carcinoma ex-pleomorphic adenoma[J].Oral oncology，2006，42（10）：1011-1016

[29] Batsakis J G，Kraemer B，Sciubba J J.The pathology of head and neck tumors：the myoepithelial cell and its participation in salivary gland neoplasia，part 17[J].Head & neck surgery，1983，5（3）：222-233

[30] Chaudhry A P，Leifer C，Cutler L S，et al.Histogenesis of adenoid cystic carcinoma of the salivary glands：light and electronmicroscopic study[J].Cancer，1986，58（1）：72-82

[31] Miguita L，Martinez E F，Araújo N S，et al.FGF-2，TGFβ-1，PDGF-A and respective receptors expression in pleomorphic adenoma myoepithelial cells：an in vivo and in vitro study[J].Journal of Applied Oral Science，2010，18（1）：83-91

[32] Sternlicht M D，Kedeshian P，Shao Z M，et al.The human myoepithelial cell is a natural tumor suppressor[J].Clinical Cancer Research，1997，3（11）：1949-1958

[33] Martins M T，Altemani A，Freitas L，et al.Maspin expression in carcinoma ex pleomorphic adenoma[J].Journal of clinical pathology，2005，58（12）：1311-1314

上皮细胞篇9

【摘要】 目的研究EBV感染人胃上皮细胞系GFS-1后PAR-2基因的表达状况及转化作用，以探讨PAR-2基因在Epstein-Baar病毒(EBV)相关胃癌发生中所起的作用。方法用携带NEO基因的重组EBV产生细胞系Akata 1061以密切接触法感染人胃上皮细胞系GF5-1，采用脂质体介导法将PAR-2基因转染至同一细胞，以pcDNA3空载体质粒转染同一细胞为对照;经G418筛选获得感染或转染的抗性细胞克隆;采用免疫细胞化学法测定EBNA1的表达以鉴定EBV感染细胞克隆，测定EBV感染和PAR-2基因转染细胞中PAR-2蛋白的表达;通过形态学观察、细胞生长曲线测定及流式细胞分析等方法观察细胞生物学特性的变化。结果与对照组相比，EBV感染及PAR-2转染后细胞发生明显的形态学变化，生长速度明显加快，S期细胞比例显著提高，分别为(70.35±0.91)%、(60.67±3.06) % 和(34.74±1.03)%，差异有显著性(P

【关键词】 Epstein-Barr 病毒(EBV);PAR-2;人胃上皮细胞;基因转染;细胞周期

Role of PAR-2 gene in EBV-transformed human gastric epititelial cells

LIU Huan-xin，CHEN Juan，LIU Mei，et al.The Hospital of Armed Police of Guangdong，Guangzhou 510507，China

[Abstract]ObjectiveTo define the role of PAR-2 gene in the carcinogenesis of EBV-associated gastric carcinoma， we examined the expression of PAR-2 in the human epithelial cell line GES1 infected with EBV and tested if EBV could induce cell transformation.MethodsAkata 1061 was used to infect GES-1 the intimate contact meth-od. pcDNA3-PAR-2 was hansfected into cells the UpofectAMINE method， whereas pcDNA3 vector was used as the control. Geneticin 418 (G418) was adopted to select positive clones that were either EBV or PAR-2 positive. Immuno-histochemical staining method was used to detect EBNAI expression in cell clones infected with EBV and the expressionof PAR-2 protein in EBV-infected or PAR-2-transfected cell clones. Morphological observations， cell growth curve de-terminations， soft agar gel formation tests， and flow cytometry were employed to measure changes in cell proliferationand cell cycle progress.ResultsCompared to the control， EBV-infected or PAR-2-transfected cells revealed significant morphological changes that were accompanied a significant increase in the cell growth velocity. The numbers of S ase cells were significantly increased(P

[Key words]Epstein-Barr virus(EBV ); PAR-2; Human gastric epithelial cell; Gene transfection; Cell cycle

胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，发病率在世界范围内的恶性肿瘤中占第二位，其发病机制目前并不十分清楚。大多数学者认为，胃癌的发生是物理、化学、生物等多因素、多阶段的发展过程。1990年Burke等[1]首次报道了1例EBV阳性胃癌，自此EBV感染与胃癌的关系受到关注[2]。EBV最初是由Epstein和Barr从非洲伯基特淋巴瘤(BL)培养中发现的，它与多种人类肿瘤有关。目前，对EBV相关胃癌的研究主要在临床病理方面，而EBV感染后胃上皮细胞变化的分子机制尚不明确。笔者采用EBV感染和PAR-2基因转染体外培养的胃上皮细胞系GES-1，对比分析细胞生物学特性的变化，从而探讨PAR-2基因在EBV致胃癌发生发展中的作用。

1材料与方法

1.1主要试剂脂质体Lipofect AMINETM 2000 regent，G418购自Invitrogen公司;小量质粒提取试剂盒、限制性内切酶、XDNA/Hind m maker，200 by DNA stepladder、琼脂糖购自华美生物技术工程公司;RPMI1640培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清(FCS)购自基因公司;免疫细胞化学染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;胃癌病人血清为来自本院肿瘤科;载体和细胞株：pcDNA3空载体质粒、pcDNA3-c-myC重组质粒及携带NEW基因的重组EBV产生细胞系Akata 1061均为广州安必平生物科技有限公司提供;人胃上皮细胞系GFS-1由南方医科大学肿瘤研究所提供;大肠杆菌HB 101由安必平生物科技有限公司提供。

1.2细胞的培养人胃上皮细胞系GES-1用含10%FCS，100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养基，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。细胞2~3天换1次液，细胞融合约达80%时，以0.25%胰蛋白酶消化传代。Akata细胞为悬浮生长的淋巴细胞，具有G418抗性。常规悬浮细胞培养方法，另含700mg/L G418。

1.3pcDNA3-PAR-2重组质粒及pcDNA3空载体质粒的获得取感受态的大肠杆菌，按质粒小量提取方法进行质粒DNA的提取和纯化，用BamHI酶切后电泳鉴定，用Quantity one图像分析软件进行灰度测定，计算提取质粒的浓度，并根据此浓度确定转染所需的量。

1.4基因转染及阳性克隆筛选将pcDNA3-c-myc重组质粒及pcDNA3空载体质粒按1：2~1：3的量用脂质体法分别转染24孔板中90%~93%融合的GES-1细胞，按试剂盒操作手册进行。37℃转染5h后，加人FCS至终浓度10%。48h后用有限稀释法进行阳性克隆，并置于含300mg/L G418(根据预实验结果而定)的选择培养基中，筛选培养2周，待抗性单克隆长至足够大，挑取单克隆集落，扩大培养，制备细胞片。EBV感染及阳性克隆筛选：感染前3天，Akata1061细胞稀释至2×103/ml，加入终浓度为0.5%山羊抗人降解血清，于37℃培养2h，不时轻轻摇动，然后以PBS洗2次，以含10 % FCS的RPMI 1640培养基继续培养。感染前1天，将GES-1细胞以2mmol/LEIYI'A/PBS消化下来，置于12孔培养板中，每孔2ml培养基，含5×103细胞。转染当天更换等体积培养基。转染时每孔加人1ml Akata细胞悬液，于37℃，5%CO2培养箱中共同培养3天。在第2天更新一半培养基，使FCS浓度降至5%。此过程结束后，以PBS洗4次，加人2 ml含10% FCS的培养基。感染后第5天，将细胞消化下来，稀释至2×102/ml，接种于96孔板中培养至克隆形成。此过程中，培养基中加入终浓度为300mmol/L的G418和终浓度为1mmol/L的更昔洛韦(仅第1周)。将所获得的细胞克隆常规培养并制备细胞片。

1.5EBNAl及PAR-2蛋白的检测将EBV感染细胞片用FTIC标记的免疫细胞化学方法检测EBNAI的表达;感染和转染细胞片检测PAR-2蛋白的表达。免疫细胞化学检测方法按说明书操作，以PBS代替一抗作为阴性对照，以细胞内出现明确亮绿色判定为阳性结果。

1.6细胞生长曲线测定取EBV感染、c-myc基因转染及对照细胞培养至对数生长期，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，经计数后以3×103个/孔接种于24孔板，每孔加人无血清培养基2ml培养1天使细胞同步化，换入含10% FCS的RPMI 1640培养基2ml继续培养。每天取4孔进行细胞计数，每孔重复计数3次，取其平均值，连续计数7天，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.7软琼脂克隆形成试验在6孔细胞培养板中，每孔先加入0.66%底层琼脂3ml(1.5ml 1.3%琼脂冷却至55℃左右，与1.5ml预温的37℃含2×RPMI1640培养基混匀)，待凝固后，加入0.33%的含细胞的上层琼脂3ml，每组细胞均做复孔。置湿盒，在37℃，5% CO2及饱和湿度环境下培养2~3周，观察软琼脂中细胞集落的形成。

1.8细胞周期的测定分别收集各组细胞，经0.25%胰酶消化，离心收集细胞，冷PBS洗涤2次。加入预冷的70%酒精，4℃固定过夜。800~1000×g离心弃上清，冷PBS离心洗涤2次并重悬，制成单细胞悬液，注意离心速度不宜过快。等体积细胞悬液和碘化丙啶( PI)染液混合，4℃放置20min×300目尼龙过滤，加样入流式细胞分析仪样品室，进行细胞周期检测。

1.9统计学处理采用SPSS13.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析。设定P

转贴于

2结果

2.1PWNA3-PAR-2重组质粒的鉴定扩增纯化的pcDNA3- PAR-2重组质粒经BamHⅠ酶切、电泳，可见PAR-2基因大小为1.3kb，pcDNA3载体为5.4kb，恰好在pcDNA3的BamHⅠ位点，与所提供的质粒图谱相符(图1)和PAR-2蛋白表达，转染了PAR-2基因的GES-1细胞有PAR-2蛋白表达，细胞均被染成亮绿色，阳性结果主要出现在细胞核，部分在细胞质，而空载体转染组及正常GES-1细胞均为阴性(图2、图3)。

2.2细胞形态学变化正常的GES-1细胞呈短梭形，大小较为一致，核较小呈圆形或椭圆形;感染及转染组细胞体积变大，呈椭圆形或多角形，核变大，核浆比增大，折光性增强，与正常GES-1细胞相比较，细胞增殖迅速，细胞生长的接触性抑制不明显，出现“成瘤性”生长(图4)。

2.3免疫组织化学染色结果FlTC标记免疫细胞化学染色显示，感染了EBV的GES-1细胞有EBNA1。

2.4细胞生长曲线测定细胞生长曲线如图3，可见EBV感染细胞及c-myc基因转染细胞数量均显著高于空载体转染细胞，并随培养时间增加，这一差异越来越明显;空载体转染细胞数与正常GES-1细胞相比差异无显著性(图3)。

2.5细胞周期测定经流式细胞仪进行细胞周期分析发现，EBV感染和c-myc基因转染细胞S期细胞比例[(70.%±0. 91%)和(67%±3 .06%)]显著高于pcDNA3转染对照细胞(34.74%±1.03%)，差异有显著性(P

3讨论

EBV是人类疱疹病毒N型，属DNA肿瘤病毒，EBV在人群中广泛存在，多数人幼儿期就感染EBV，且终生携带。EBV与BL、鼻咽癌(NPC)的关系最为明确，近年来EBV在上皮源性肿瘤发生、发展中的作用备受关注。1990年等[1]Burke首次报道了1例EBV阳性胃癌以来，EBV感染与胃癌的关系受到关注。c-myc原癌基因在多种人类肿瘤细胞中均有扩增和高表达。有研究表明，在EBV相关的多种肿瘤如BL、NPC中都存在。my基因高表达[3]，而PAR-2基因过度表达可以改变细胞内基因调控，引起其他癌基因的活化或抑癌基因的失活，使细胞易于转化为恶性表型，从而启动或加速肿瘤发生[4，5]。在对人鼻咽上皮细胞的研究中发现，c- my基因表达增高能激活端粒酶活性，从而诱发肿瘤。有报道EBV阳性胃癌表达EBNA 1、BARFO、BARE 1和EBERs[6~8]，将BARE 1基因导入非致瘤性louckes淋巴细胞中可活化PAR-2原癌基因[9]。另外，临床病理学研究发现患有PAR-2产物阳性浸润性胃癌的病人预后明显差于PAR-2产物阴性肿瘤的病人[10]。因此推测PAR-2基因在EBV相关胃癌的形成过程中起到一定的作用。实验中用的GES-1细胞为SV40感染原代培养的胎儿正常胃黏膜上皮细胞建立的细胞系，染色体为近三倍体(50~60之间)。除了转化特性之外，GES-1细胞基本保留了正常的细胞骨架结构，角蛋白反应阳性，接种在裸鼠中6个月观察无致瘤性，此细胞系为研究胃上皮细胞癌变提供重要的模式系统。Akata细胞来源于EBV阳性BL病人，通过同源重组插入一个新霉素抗性基因(Neo)，因此具有G418抗性。经抗免疫球蛋白处理后，能产生大量重组EBV(每个细胞含EBV质粒20个拷贝)。Akata细胞适合重组EBV克隆繁殖，是探测EBV遗传学的有效工具，使EBV作为基因治疗的载体成为可能[10]。本实验中，感染上皮细胞前，Akata细胞以0.5%山羊抗人降解血清预处理，目的即是产生大量重组EBV。由于Akata细胞中含另一个药物敏感基因(大T基因)，因此培养基中加人1pmol的更昔洛韦后，Akata细胞被除去。用Imai等[11]创立的密切接触法使人胃上皮细胞系GES-1感染重组EBV，用碱裂解法获得质粒，经过酶切鉴定后采用脂质体介导法将PAR-2基因转入GES-1细胞，以pcDNA3空载体质粒转染同一细胞为对照，由于pcDNA3携带GADPH基因，因此也具有G418抗性。经过G418筛选得到EBV感染和PAR-2基因转染的阳性克隆。对感染和转染细胞进行鉴定，用荧光(ME)和辣根过氧化物酶(HIiP)两种标记方法，细胞均被染成亮绿色或棕褐色，说明感染和转染获得成功，细胞均为阳性克隆。本实验中，用细胞计数和Mil两种方法测定细胞生长曲线，结果均显示从第3天开始EBV感染组与c-myc基因转染组细胞生长速度与对照组相比明显加快，并且随着培养时间的延长，这一差距越来越明显，到第7天EBV感染组细胞达到3.85×105个，几乎为对照组细胞数量的2倍，PAR-2基因转染组细胞数为3.14×105个，与感染组相比差异无显著性。细胞周期测定显示感染与转染组细胞S期细胞数目增多，两组之间差异无显著性，说明处于增殖期的细胞较多，此结果与细胞生长曲线结果相一致。经过荧光染色发现EBV感染细胞中有c-myc基因表达，提示EBV感染上皮细胞后可能通过某种方式上调PAR-2基因，引起其他癌基因变化，进一步影响细胞周期，使细胞增殖加快，从而使细胞发生永生化。实验中EBV感染的GES-1细胞发生明显形态学改变，由原来的短梭形变得更为饱满，细胞及细胞核体积明显增大，核浆比增大，细胞增殖迅速，细胞生长的接触性抑制不明显，说明EBV感染的细胞已经具有肿瘤细胞的某些特性。正常细胞生长依赖锚泊，有密度依赖抑制或接触抑制，肿瘤细胞则缺乏这种生长限制，甚至可在半固体琼脂中成悬浮生长，不需要依附固定表面，不受密度限制，可持续分裂堆积生长。软琼脂集落形成试验是测定细胞成瘤性的一种有效方法。单细胞在体外持续增殖6代以上所组成的细胞群体，称为集落或克隆，可含有50个以上的细胞，大小在0.3~1.0mm之间。通过计数集落形成率，可对细胞的增殖潜力做定量分析[11]。本实验中软琼脂中未见有细胞集落形成，提示EBV感染虽然可使胃上皮细胞增殖加快，但尚未转化为肿瘤细胞，即胃上皮细胞尚未发生癌变。究其原因，可能是因为实验中EBV感染上皮细胞的时间相对较短，而EBV相关胃癌的发生可能与EBV的长期潜伏有关。另外，肿瘤发生过程中癌基因与抑癌基因的相互作用也是一个漫长的发展过程。这种增殖加快的上皮细胞是否属于癌前病变的细胞，有待进一步研究。综上所述，EBV相关胃癌的发生及发展过程是十分复杂的。EBV感染胃上皮细胞后，表达诸如BARF1之类的病毒基因，通过这些基因产物激活c-myc、PAR-2基因等癌基因及一系列抑癌基因，进而影响细胞周期，细胞增殖加快，再在某些因素的影响下转变为肿瘤细胞。因此，PAR-2基因基因可能是EBV阳性胃癌发生发展过程中的关键介导基因。(本文彩图见封三)

【参考文献】

1DI Burke AP，Yen I'S，Shekitka KM，et al. Lymphoepithelial carcinoma o' the stomach with Epstein-Bar virus demonstrated by polymerise chain reaction. Mod Pathol，1990，3(3):377-380.

2Ishii H，Gobe G，Kawakubo Y，et al. Interrelationship between stein-Barr virus infection in gastric carcinomas and the expression of optosis-associated proteins. Histopathology，2001，38(2):111-119.

3Shimizu N，Tanabe-Tochikum A，Kuroiwa Y，et al. Isohrt-Ep- stein-Barr virus (EBV)-negative cell clones from the EBV positive Bur-kitt's lymphoma (BL) line Akata: malignant phenotypes of BL cells，dependent.EBV J Virol，1994，68(9):6069-6073.

4Imai S，Koizumi S，Sugiura M，et al. Gastric carcinoma:monoclonal epithelial malignant cells expressing Epstein-Barn virus latent infection protein. Proc Nail Acad Sci USA，1994，91(19):9131-9135.

5Zur Hausen A，Brink AA，Craanen ME，et al. Unique transcription pattern of Epstein-Barr virus (EBV) in EBV-carrying gastric adenocarcinomas: expression of the transforming BARFI gene. Cancer Res，2000，60(10):2745-2748.

6Sugiura M，Imai S，Tokunaga M，et al. Transcriptional analysis of Ep steirr-Barr virus gene expression in EBV-positive gastric carcinoma;unique viral latency in the tumour cells. Br J Cancer，1996，74(4): 625-631.

7Wei MX，Moulin JC，Decaussin G，et al. Expression and tumorigenici-ty of the Epstein-Barr virus BARFI gene in human Louckes B-lympho-cyte cell line. Cancer Res，1994，54(7):1843-1848.

8Imai S，Nishikawa J，Takada K. Cell-to-cell contact as an efficient mude of Epstein-Barr virus infection of perse human epithelial cells. J Viral，1998，72(5):4371-4378.

9U XN，Du ZW，Huang Q，et al. Growth-inhibitory and ditferentitation inducing activity of dimethynomtamide in cultured human malignant cells. Neurosuegery，1997，40(6):1250-1258.

10Fujimoto D，hirono Y，goi T，et al.Expression of protease activated receptor-2(PAR-2)in gastric cancer. J Surg Oncol，2006，93(2):139-144.

上皮细胞篇10

【摘要】 目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)对小鼠肾上腺皮质细胞系Y1增殖、凋亡的影响。方法:不同浓度、不同作用时间的TNFα处理小鼠肾上腺皮质细胞系Y1;MTT法检测细胞的增殖;台盼蓝拒染法检测细胞增殖抑制;流式细胞仪检测细胞的凋亡水平;分光光度法检测细胞caspase8/3的变化。结果:不同浓度的TNFα处理Y1细胞不同时间后，细胞的增殖能力明显下降(P

【关键词】 肿瘤坏死因子α; Y1细胞; 增殖; 凋亡; caspase8; caspase3

[Abstract] Objective: To investigate the effects of tumor necrosis factor α(TNFα) on proliferation and apoptosis of mouse adrenal cortex cell lines Y1. Methods: The mouse adrenal cortex cell line Y1 was treated with TNFα at different concentrations during different duration. The cells proliferation was tested by MTT assay and cytostasis was detectd by Trypan Blue Coloring Method. Flow cytometry was used to observe the cells apoptosis level. The changes of Caspase8/3 of the cells were detected by spectrophotometry. Results: After being treated with TNFα of different concentration during different duration， reproductive activities of Y1 cells were significantly inhibited(P

[Key words] tumor necrosis factor α; Y1 cells; proliferation; apoptosis; caspase8; caspase3

肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种主要由单核巨噬细胞产生的单核因子，具有选择性地杀伤某些哺乳类动物的肿瘤细胞，并通过半胱天冬酶级联介导和活化激活蛋白1、核因子κB两个转录因子的通路诱导其凋亡。近些年来，TNFα对内分泌细胞的作用逐渐受到关注。2007年，Mikhaylova等[1]研究发现，TNFα可以降低人类肾上腺皮质NCIH295R细胞的增殖活性并诱导其凋亡。但是，它诱导内分泌细胞凋亡的机制目前尚不明确，而且不同细胞对TNFα的敏感性亦不相同。本研究旨在探讨TNFα对小鼠肾上腺皮质细胞增殖、细胞凋亡及其可能机制，为今后深入了解TNFα介导的炎症反应对小鼠肾上腺皮质功能的影响提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠肾上腺皮质细胞系Y1(中国科学院上海细胞生物研究所);肿瘤坏死因子α(TNFα)(Peprotech公司);F12培养基(GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、MTT(GIBCO公司)、DMSO(Sigma公司);台盼蓝染液(南京生兴生物技术有限公司);Annexin VFITC及PI细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司);caspase8/3分光光度法检测试剂盒(南京凯基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 小鼠肾上腺皮质细胞系Y1用含10%的胎牛血清、1.176 g NaHCO3及100 IU·L-1青链霉素的F12培养液，在体积分数为0.05的CO2、37 ℃、湿饱和的条件下培养。细胞生长至80%融合时，用0.25%的混合胰酶消化后按1瓶传至2～3瓶进行传代，取其对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT比色法检测细胞增殖 将处于对数生长期Y1细胞用0.25%的胰酶消化，进行细胞计数，调整浓度为1×105 ml-1，将细胞均匀接种96孔培养板，每孔200 μl，每孔细胞约为2×104个。过夜贴壁后，更换无血清培养液，培养24 h后实验组分别加入100、200、250 U·ml-1的TNFα 200 μl。阴性对照组加入等体积的F12培养液。细胞在体积分数为0.05的CO2、37 ℃条件中分别培养6、12、24、48 h后，加入5 mg·ml-1 MTT 20 μl，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃培养上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，使结晶充分溶解。在酶标仪上测定波长为490 nm的OD值，最后以抑制率为纵坐标，以时间为横坐标，绘制生长曲线。实验重复3次。药物对细胞增殖的抑制率(IR)=[1-(用药组测定的平均OD值/对照孔测定的平均OD值)]×100%。

1.2.3 台盼蓝拒染法检测细胞数目 取对数生长期的Y1细胞，调整细胞浓度为1.0×105～2.0×105 ml-1，接种于6孔板，每孔1 ml，用药组分别加入100、200、250 U·ml-1的TNFα 1 ml，每组设3个平行孔，并设阴性对照组。细胞加药后在体积分数为0.05的CO2、37 ℃条件中分别培养6、12、24、48 h后，然后按1∶10加入0.4%的台盼蓝，染色2～3 min，在光学显微镜下行活细胞计数。药物对细胞增殖的抑制率(IR)=[1-(用药组平均活细胞数/对照组平均活细胞数)]×100%计算。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡 分别收集经100、200、250 U·ml-1的TNFα处理并培养6、12、24、48 h后的实验组细胞及等量F12培养液培养的阴性对照组细胞，常规胰酶消化后制成单细胞悬液，离心弃上清液，再经预冷的PBS洗2次，按AnnexinV /FITC及PI试剂盒提供方法依次加入结合缓冲液、AnnexinV/FITC及PI，室温避光15 min后上机测试，采用FACS Calibur流式细胞仪对样品进行检测，每次计细胞数5 000个，激发波长488 nm，分析软件CellQuest计算凋亡率。实验重复3次。

1.2.5 caspase8/3 活性检测 用分光光度法检测caspase8/3的活性。分别收集经100、200、250 U·ml-1 TNFα处理并培养6、12、24、48 h后的实验组细胞及等量F12培养液培养的阴性对照组细胞，进行细胞计数，调整浓度为1×105 ml-1，将细胞均匀接种96孔培养板，每孔100 μl，每孔细胞约为1×104个。阴性对照组加入等体积的F12培养液。用振荡器振荡30 s使混合物混合均匀，在37 ℃继续避光孵育4 h。在酶标仪上测定波长为405 nm的OD值，实验重复3次。

1.3 统计学处理

采用SPSS 11.0软件进行数据处理，实验结果用±s表示，多组资料比较行oneway ANOVA分析，组间比较行oneway ANOVA检验，P

2 结 果

2.1 TNFα抑制Y1细胞的增殖

100、200、250 U·ml-1的TNFα作用于细胞6、12、24、48 h后均可抑制细胞增殖。与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P

2.2 台盼蓝拒染法检测Y1细胞增殖抑制

100、200、250 U·ml-1的TNFα作用于细胞6、12、24、48h后均可抑制细胞增殖。与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P

2.3 TNFα促进Y1细胞的凋亡

100 U·ml-1的TNFα作用细胞48 h凋亡率为9.2%，与阴性对照组(凋亡率为7.7%)比较，差异无统计学意义(P>0.05);而200、250 U·ml-1的TNFα作用细胞48 h后凋亡率分别为16.6%、22.3%，与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P

2.4 TNFα激活Y1细胞caspase8/3的活性

100、200、250 U·ml-1的TNFα作用于细胞6、12、24、48 h后均可使caspase8和caspase3活性增强(P

3 讨 论

TNFα是一种多功能的细胞因子，通过受体介导而作用于靶细胞，对肿瘤细胞具有细胞毒性、免疫调控作用[2]。不同细胞对TNFα的敏感性不同。本研究应用MTT法和台盼蓝拒染法测定了TNFα对小鼠肾上腺皮质细胞的增殖抑制作用，研究显示，在不同浓度的TNFα作用细胞不同时间后，细胞的增殖抑制率受到明显影响，并且这种抑制性呈时间剂量依赖性。

TNFα参与到细胞因子介导的免疫系统和下丘脑垂体肾上腺轴之间的交流中[3]，TNFα的受体在下丘脑和垂体前叶表达。TNFα是一种在发生组织损伤、感染、炎症和许多其他刺激时大部分由活化的单核细胞和巨噬细胞合成的炎症细胞因子，可激活两个主要的信号通路：半胱天冬酶级联导致的凋亡和另一个导致2种主要转录因子(激活蛋白1和核因子κB)活化的通路，它依次诱导参与炎症反应和凋亡抑制的基因的活化[4-5]。TNFα通过2个受体介导它的作用(TNFR1和TNFR2)。在TNFR1未与TNF结合之前，TNFR1的胞内区与死亡结构域沉默子(silencer of death doman，SODD)结合，抑制了TNFR1的死亡结构域(death domain，DD)与TNFR1等接头分子的结合，阻断了TNFR1活化所致的细胞凋亡;当三聚体TNF与TNFR1的胞外区结合，引起TNFR1的三聚化，胞内区的SODD被释放，TNFR1胞内区的死亡结构域与TRADD死亡区域结合蛋白(TRADDassociated death domain protein，TRADD)相结合，产生2种不同的诱导调节机制：(1)通过TNFR1TRADDFADD途径招募FLICE(FADDlike ICE)/MACH(MORT1associated CED3 homolog)/caspase8，再激活caspase3，诱导细胞凋亡;(2)通过TNFR1TRADDTRAF(TNF receptorassociated factors)激活NFκB，TRADD还能通过DD招募RIP(reportor interecting protein)激活NFκB，活化的NFκB调控各种基因的表达，抑制细胞凋亡和促进炎症反应。但上述的经典模型已受到挑战，Harper等[6]研究表明，在初始膜基部TNFR1复合物中没有发现FADD以及caspase8被招募。Micheau等[7]提出，TNFR1介导凋亡的新途径：受到TNF的刺激后，TNFR1、TRADD、TRAF2和RIP等在膜上快速装配形成复合物Ⅰ，此复合物触发NFκB的活化，但迅速消失，大部分TRAF2和RIP在1 h内与TNFR1分离，接着TRADD的DD结合域再与FADD结合，进而招募、活化caspase8，形成复合物Ⅱ，诱导细胞凋亡。TNFR2虽不具有DD结构域，但有结合TNF受体相关因子(TRAF)的基序，TNFR2与TRAF结合形成复合体激活NFκB和JNK激酶，诱导基因转录，促进细胞存活、增殖和分化。Till等[8]将TNFR2的Met196替换为Arg，突变体TNFR2招募TRAF2的能力以及诱导依赖NFκB的基因如cIAP表达大幅减少，引起不同程度的慢性炎症机能紊乱。Liu等[9]研究认为TNFα是调节肾上腺皮质细胞凋亡的重要调节因子。本实验结果也显示，经TNFα处理过的Y1细胞的细胞凋亡率与对照组比较有明显差异(P

TNFα在其介导的炎症反应过程中，可引起全身难以控制的“瀑布式炎症级联反应”或伴免疫功能的严重抑制，即全身炎症反应综合征或代偿性抗炎反应综合征，是患者死亡的主要原因。本研究的结果提示，TNFα作用与小鼠的肾上腺皮质细胞的增殖和凋亡密切相关，下一步将深入了解TNFα介导的炎症反应对小鼠肾上腺皮质功能的影响。

参考文献

[1] MIKHAYLOVA I V， KUULASMAA T， JASKELINEN J， et al. Tumor necrosis factorα regulates steroidogenesis，apoptosis， and cell viability in the human adrenocortical cell line NCIH295R[J]. Endocrinology， 2007，148(1):386392.

[2] IWASAKI K， ROGERS L R， BARNETT G H， et al. Effects of recombinant tumor necrosis factoralpha on threedimensional growth， morphology， and invasiveness of human glioblastoma cells in vitro[J]. Neurosurg， 1993，78:952958.

[3] CHESNOKOVA V， MELMED S. Minireview: neuroimmunoendocrine modulation of the hypothalamicpituitaryadrenal(HPA) axis by gp130 signaling molecules[J].Endocrinology， 2002，143(7):15711574.

[4] HEYNINCK K， BEYAERT R. Crosstalk between NFκBactivating and apoptosis inducing proteins of the TNFreceptor complex[J]. Mol Cell Biol Res Commun， 2001，4：259265.

[5] BAUD V， KARIN M. Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives[J]. Trends Cell Biol， 2001，11：372377.

[6] HARPER N，HUGHES M，MACFARLANE M，et al.Fasassociated death domain protein and caspase8 are not recruited to the tumor necrosis factor receptor 1 signaling complex during tumor necrosis factor induced apoptosis[J].J Biol Chem，2003，278(28):2553425541.

[7] MICHEAU O，TSCHOPP J.Induction of TNF receptor Ⅰmediated apoptosis via two sequential signaling complexes[J].Cell， 2003，114：181190.