桑树总生物碱分析论文

1材料与仪器

桑叶总生物碱提取物为市售产品(DNJ含量>50%)。桑叶、桑椹、桑白皮、桑枝药材购于成都荷花池中药材专业市场，经鉴定为Morusalba的干燥叶、果、根皮和嫩枝。硅胶G（青岛海浪化工厂）、732阳离子交换树脂(上海汇珠树脂有限公司)、中性氧化铝(成都市科龙化工试剂厂)、活性炭(成都市科龙化工试剂厂)，其余各种试剂为化学纯或分析纯。TU-1800紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

2方法与结果

2.1桑树总生物碱分析方法的研究实验中以桑叶总生物碱提取物为样品进行了分析方法的研究；后经证实，桑椹、桑白皮和桑枝的总生物碱实验结果与之一致。

2.1.1检识反应与生物碱沉淀试剂的反应：取桑叶总生物碱提取物适量，加蒸馏水溶解，以盐酸调pH2～3，过滤，所得溶液为浅黄色，取5份，分别与碘化铋钾试剂、碘-碘化钾试剂、硅钨酸试剂、磷钼酸试剂、苦味酸试剂反应，结果见表2。表2桑叶生物碱的检识反应（略）

碘化铋钾、硅钨酸、磷钼酸与样品呈阳性反应，可用于定性鉴别。

亚硝酸反应：考虑到DNJ属于脂肪族仲胺，应能与亚硝酸进行反应。试验时取上述桑叶总生物碱提取物的酸水溶液，置试管中，加入亚硝酸钠水溶液，结果产生气泡，持续时间近1h，随着气体的逸出，试管口颜色逐渐变深，几乎呈褐色，而溶液的颜色则由浅黄色变为深黄色。

2.1.2薄层色谱分析桑树生物碱的薄层色谱分析鲜有报道，主要是由于DNJ及其类似物显色困难。实验中取桑叶总生物碱提取物的水溶液，点样于硅胶G板上，以醋酸乙酯-甲醇-冰醋酸(6∶2∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，显色，检识。曾实验碘化铋钾、磷钼酸、碘蒸气、10%硫酸-乙醇、α-萘酚、Enrilich试剂、苯胺-二苯胺-磷酸试剂、0.15%高锰酸钾等薄层色谱显色剂，结果碘化铋钾显色不明显，其他试剂均未能显色。

有文献报道［18］，采用茚三酮试剂能使DNJ显紫色斑点。经试验，茚三酮能使样品的薄层板显出斑点，但是，用茚三酮显色不能排出氨基酸的干扰，而亚硝酸反应产生气泡表明样品中可能存在氨基酸。后终于找到氯-邻联甲苯胺试剂，能使样品的薄层板显红黄色斑点。若令薄层板不显色，刮取氯-邻联甲苯胺试剂能显色的相应位置的硅胶，以甲醇洗脱，洗脱液挥除溶剂，酸水溶解，加碘化铋钾试剂，结果呈阳性反应，表明氯-邻联甲苯胺试剂能使桑叶生物碱显色。又取谷氨酸水溶液，与桑叶总生物碱提取物平行试验，结果，氯-邻联甲苯胺试剂不能使谷氨酸显色。因此，桑叶总生物碱用氯-邻联甲苯胺试剂显色具有专属性。氯-邻联甲苯胺试剂显色的具体方法为：取少量高锰酸钾置密闭容器中，加适量浓盐酸令产生氯气，将薄层板放入，15min后取出，置空气中5min以上以除去氯气，然后喷以邻联甲苯胺溶液(160mg邻联甲苯胺溶于30ml冰醋酸，加水至500ml，再加1g碘化钾)，即可显色。桑叶生物碱提取物的薄层色谱图如图2所示。

2.1.3含量测定方法的提出实验发现，桑叶生物碱经氯-邻联甲苯胺试剂显色后，在2h内未见褪色，5h后慢慢褪色，显色较为稳定。刮取斑点，用甲醇洗脱，取洗脱液在200～800nm范围内扫描，结果在209nm和446nm处有吸收峰，如图3所示。后来发现，若样品薄层色谱中有多个斑点，这些斑点的光谱图基本一致。据此可提出含量测定方法：以DNJ为对照品，用薄层色谱-分光光度法进行测定。

由于209nm属于末端吸收峰，若用于含量测定则误差较大，故宜选用446nm作测定波长。经试验，甲醇洗脱液放置2h，446nm处的吸光度值基本不变，表明方法的耐用性良好。因此确定总生物碱的含量测定方法可采用薄层色谱-可见分光光度法。

另外，根据斑点颜色清晰、稳定、以及不同斑点光谱图基本一致的性质，也可以考虑以DNJ为对照品，用薄层扫描法进行含量测定。

2.2桑树总生物碱提取方法的研究本文桑树总生物碱的提取、纯化是建立在对结构、性质的分析的基础之上的。

2.2.1根据桑树生物碱的结构推测其理化性质

溶解性：由表1可知，DNJ类化合物为氮杂糖型结构，羟基较多，极性较大，因此可溶于水、醇类溶剂，在氯仿等弱极性溶剂中、醋酸乙酯等中等极性溶剂中应不能溶解或溶解度很小，因此，传统的生物碱提取方法(酸水提取、氯仿萃取)将不适用，但可考虑用水、醇类溶剂提取。

碱性：由表1可知，桑树生物碱多为脂肪族仲胺或叔胺，因此具有弱碱性，在一定pH条件下能成为离子状态，故可以考虑用离子交换色谱进行纯化。另外，也以考虑使用氧化铝等碱性吸附剂进行分离。

水解性：对于氮杂糖本身而言，其化学性质非常稳定，在酸、碱、热作用下不易分解。但根据表1，不少生物碱成分以糖苷的形式存在，苷在酸性条件下尤其是加热时易被水解，因此，提取分离中若使用酸时应注意不能使作用时间太长，并应尽量避免在酸性条件下加热。

2.2.2桑树生物碱的提取工艺流程根据上述结构与性质的分析，本文提出了以下的提取工艺流程。各提取步骤分别进行沉淀反应和薄层色谱跟踪分析，以保证各工序所得到的成分为生物碱。

水提醇沉：取桑叶、桑椹、桑白皮、桑枝药材，分别加水煎煮提取，煎液浓缩至一定体积，放冷后加乙醇使含醇量达70%，静置过夜，滤取上清液，回收乙醇，得提取液。

离子交换树脂富集：取上述提取液，适当稀释，用10%盐酸调pH4～5，流经已预处理的732阳离子交换树脂柱，树脂柱先以水洗至近中性，弃去水洗液，再用0.25mol/L氨水洗脱，收集洗脱液，适当浓缩。

正丁醇萃取：取上述浓缩液，以等量的水饱和的正丁醇萃取，共3～4次，分取正丁醇层，减压回收溶剂，得正丁醇萃取物。

氧化铝柱层析：取正丁醇萃取物，用少量水溶解，上样于氧化铝干柱，以乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，得氧化铝纯化物。

活性炭脱色：取氧化铝纯化物，以水溶解，加适量活性炭，煮沸15min，放冷，过滤，滤液浓缩除去溶剂，即得到总生物碱产品。

2.2.3产品的初步分析

沉淀反应：取上述产品，加水溶解，以盐酸调pH2～3，分别加碘化铋钾试剂、硅钨酸试剂、磷钼酸试剂，结果4味药的总生物碱均呈阳性反应。

薄层色谱分析：薄层色谱条件同上。结果如图4所示。

3讨论

中药有效成分的分析方法与提取方法建立的前提是对目标成分理化性质有充分的认识。本文在分析桑树生物碱结构与性质的基础上，根据实验结果提出了桑树总生物碱的新的定性定量方法和提取分离方法，方法可行性较好，但方法中的具体参数仍有待进一步研究，所得总生物碱的含量尚待测定。

曾考虑采用酸性染料比色法进行桑树总生物碱的定量分析，但实验发现该方法干扰很大。

亚硝酸反应中，有气体产生，表明样品应存在含伯胺基的化合物，很有可能是氨基酸。后用谷氨酸进行亚硝酸反应，结果能产生大量气体。

薄层色谱图中，点样原点亦明显显色，表明可能有部分生物碱成分停留在原点尚未展开，因此本文的薄层色谱条件尚需优化。

氯-邻联甲苯胺试剂使桑树生物碱显色的原理可能是：新生态氯使生物碱氯代，然后氯代物与邻联甲苯胺发生缩合反应生成联苯醌而显黄色［19］。

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【摘要】目的研究桑树总生物碱的分析方法和提取方法。方法采用理化反应和薄层色谱对桑叶生物碱进行定性定量分析。通过对桑树生物碱成分的结构特征的分析设计提取纯化方法。结果发展了桑树生物碱的薄层色谱方法，给出了从桑叶、桑椹、桑白皮和桑枝中提取总生物碱的方法。结论薄层色谱-可见分光光度法可用于桑树总生物碱的定量分析，所提出的总生物碱提取方法具有可操作性。

【关键词】桑树；总生物碱；分析方法；提取方法