绵毛鹿茸草次生代谢产物含量分析论文

【摘要】［目的］绵毛鹿茸草的次生代谢产物含量与抑菌活性分析。［方法］对绵毛鹿茸草不同提取液的总黄酮、总绿原酸、总生物碱、总皂甙、游离蒽醌等次生代谢产物含量和抑菌活性进行测定。［结果］显示：70%乙醇提取液、60%丙酮提取液对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有中等抑制作用，水提取液有弱抑制作用；70%乙醇提取液是肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌的良好抑制剂，60%丙酮提取液是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的良好抑制剂。［结论］绵毛鹿茸草提取掖对大肠杆菌的抑菌活性与绿原酸的含量具有显著的正性关，对枯草芽孢杆菌的抑菌活性与蒽醌之间存在极显著的相关性。

【关键词】绵毛鹿茸草；次生代谢；抑菌活性

Abstract：［Objective］ToanalysethecontentofsecondarymetabolismsandantibacterialactivityofMonochasmaSavatieriFranch.exMaxim.［Method］Thecontentsof5secondarymetabolitessuchasflavonoid，chlorogenicacid，tannin，phenolandanthraquinonesinthedifferentextractsofMonochasmasavatieriFranch.exMaximweredetermined.［Results］Itshowedthattheantibacterialactivityoftheliquidsextractedwith70%ethanol，60%acetoneonStreptococcuspneuoncae，Staphylococcusaureus，EscherichiacoliandBacillussubtilisweremoderate，whilethatoftheliquidsextractedwithwaterwasweak.Theliquidsextractedwith70ethanolwerethebetterinhibitorofStreptococcuspneuoncaeandStaphylococcusaureus，whiletheliquidsextractedwith60acetonewerethebetterinhibitorofEscherichiacoliandBacillussubtilis.［Conclusion］TherewaspositivecorrelationbetweentheantibacterialactivityoftheliquidsofMonochasmasavatieriFranch.exMaximonEscherichiacoliandthecontentofthechologenicacid.TherewasalsomarkedcorrelationbetweenthatofBaillussubtilisandanthraquinones.

Keywords：monochasmaSavatieriFranch.exMaxim；secondarymetabolism；antibacterialactivity

绵毛鹿茸草(MonochasmasavatieriFranch.exMaxim)为唇形科鹿茸草属植物，别名白头翁、千重塔、白头毛，分布于浙江、福建、江西，常生于山坡向阳处杂草中或马尾松林下［1］。主要功能为清热解毒，祛风行气，凉血止血，祛痰，用于感冒，慢性气管炎，肺炎，咳血，吐血，便血，牙龈炎，牙髓炎，乳痈，痈肿，小儿口疮，风湿关节痛等。本文对绵毛鹿茸草的不同提取液中总黄酮、总绿原酸、总生物碱、总皂甙及其对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌抑菌活性进行研究，并探讨这五类次生代谢产物与抑菌活性之间的相互关系。

1实验与方法

1.1实验材料和仪器绵毛鹿茸草于2007年6月采自浙江千岛湖姥山林场的山坡上。采集时将棉毛鹿茸草全草用湿布包裹，塑料袋封装，立即带回实验室。将材料洗净，防入105℃恒温干燥箱中固定25min，再在80℃条件下干燥24h，研磨后经过0.25mm金属网筛，将烘干样品放入磨口广口瓶，置于干燥器中保存，备用［2］。标准品芦丁、绿原酸、小蘖碱、人参皂甙Rb，1，8二羟基蒽醌购自中国药品生物制品检定所，所用试剂均为分析纯。四种菌种均由浙江台州医院无偿赠送。培养基为牛肉膏培养基。吸光度的测定在T6新世纪紫外-可见分光光度计上完成。

1.2绵毛鹿茸草提取液的制备称取绵毛鹿茸草粉末3份，每份1g，其中2份分别用70%乙醇、60%丙酮在80℃水浴中回流6h，进行提取，离心取上清液，并清洗残渣2次，离心取上清液，将3次上清液合并；另1份用沸水进行提取0.5h，离心取上清液，反复多次，直至提取液色淡，并将几次沸水提取液混合。将乙醇、丙酮、沸水提取液的浓缩，并调节pH至7.0，然后用蒸馏水定容至1ml，放入4℃的冰箱中待用。

1.3次生代谢产物含量的测定

1.3.1总黄酮的提取与测定［3］取上述绵毛鹿茸草提取液样品0.2ml，挥去溶剂后用甲醇定容至25ml，取其中1ml，置10ml离心管中，加入4ml0.1mol/L三氯化铝-甲醇溶液，摇匀，在420nm处测定吸光度。以芦丁为标准品，其回归方程为y=9.6101x+0.0147，R2=0.9991。

1.3.2总绿原酸的提取与测定［4］取上述绵毛鹿茸草提取液样品0.2ml，挥去溶剂后用95%乙醇定容至25ml，取1ml，置25ml容量瓶中，加入0.2mol/LHCl定容至刻度，摇匀，以试剂空白为对照，在324nm处测定吸光度。以绿原酸为标准品，其回归方程为y=66.064x+0.0134，R2=0.9995。

1.3.3总生物碱的抽提与测定［5］取上述绵毛鹿茸草提取液样品0.2ml，挥去溶剂后用90%乙醇定容至25ml。取提取液1.4ml置于精密加入4ml氯仿的分液漏斗中，加入7.2×10-4mol/L溴甲酚绿pH=4.42缓冲溶液0.6ml，振摇1min，静置1h，取澄清的氯仿液，以试剂空白作对照，于417nm处测定吸收度。以小檗碱为标准品，其回归方程为y=6.6x-0.0102，R2=0.9999。

1.3.4总皂甙的提取与测定［6］取上述绵毛鹿茸草提取液样品0.2ml，挥去溶剂后用甲醇定容至25ml，取1ml置25ml容量瓶中，挥去溶剂后，加入0.2ml5%香草醛冰醋酸溶液，再加入0.8ml高氯酸，于70℃水浴加热20min，取出，冷却，加5ml冰醋酸，以试剂空白作对照，于560nm波长处测其吸光度。以人参皂甙Rb为标准品，其回归方程为y=27.763x+0.0901，R2=0.9716。

1.3.5游离蒽醌的提取与测定［7］取上述绵毛鹿茸草提取液样品0.2ml，放入10ml离心管中，水浴蒸干溶剂，加入5%醋酸镁乙醇溶液5ml，以试剂空白为对照，在498nm处测定吸光度。以1，8二羟基蒽醌为标准品，其回归方程为y=47.464x+0.0012，R2=0.9996。

1.4抑菌活性的研究以滤纸琼脂扩散法测定绵毛鹿茸草三种溶剂提取物对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效果。将经过记数的菌液稀释后，控制100μL含104cfu，涂平板。将灭菌后滤纸片（直径为6mm）浸泡在棉毛鹿茸草提取液中。在已涂菌的平板上放置上述滤纸片，并以蒸馏水为阴性，链霉素为阳性对照，每一样品重复3次。处理后的平板放在30℃培养24h，观察并记录抑菌圈的直径大小［8］。

1.5数据的处理试验处理及数据测定均重复3次，将所得数据输入SPSS11.5forWindows数据分析系统进行统计，并对次生代谢产物的含量与抑菌圈的大小进行相关分析。

2结果与分析

绵毛鹿茸草不同提取液次生代谢产物含量以及它们对四种细菌的抑菌圈大小如表1所示。其中次生代谢产物的含量为百分含量，抑菌活性以抑菌圈的大小（mm）表示，阴性对照抑菌圈直径6mm，阳性对照（链霉素）抑菌圈26mm；抑菌圈直径在6～8mm为微弱抑菌，8～12mm为弱抑菌，12～20mm为中等抑菌，20～24mm为强抑菌。绵毛鹿茸草的的次生代谢产物和抑菌圈直径的相关性如表2所示。

表1绵毛鹿茸草提取液次生代谢产物的含量（g/kg）及其抑菌圈直径（略）

2.1绵毛鹿茸草提取液次生代谢产物含量和抑菌活性分析从表1中可以看出：总黄酮、总绿原酸、游离蒽醌三种次生代谢产物的含量均为70%乙醇提取液>60%丙酮提取液>水提取液，最高含量分别为1.403g/kg、72.752g/kg、0.043g/kg；生物碱和皂甙的含量为60%丙酮提取液>70%乙醇提取液>水提取液，最高含量为1.677g/kg和5.418g/kg。中国论文联盟

对进肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用均是60%丙酮提取液>70乙醇提取液>水提取液，最大抑菌圈直径为15.47mm和17.40mm，为中等抑菌作用；对大肠杆菌和枯草杆菌的抑制作用是70乙醇提取液>60%丙酮提取液>水提取液，最大抑菌圈直径为19.03mm和14.83mm，为中等抑菌作用。水提取液对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径均在9～12mm之间，具有弱抑菌作用。可以看出绵毛鹿茸草的70%乙醇提取液和60%丙酮提取液是良好的抑菌剂。

2.2不同提取液的次生代谢产物含量与抑菌活性的相关性分析从表2可以看出：黄酮与蒽醌之间存在显著的正相关，推测绵毛鹿茸草中这两种次生代谢产物可能具有相同的合成底物或具有相同代谢途径；大肠杆菌的抑菌活性与绿原酸的含量具有显著的正性关，推测绵毛鹿茸草对大肠杆菌的抑制作用可能是提取液中的绿原酸起的作用；蒽醌与枯草芽孢杆菌之间存在极显著的相关性，说明绵毛鹿茸草对枯草芽孢杆菌的抑制作用主要是蒽醌作用的结果；肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌之间具有显著的相关性，而与所测的5种次生代谢产物之间都没有显著相关性，因此推测绵毛鹿茸草中其它某些物质对肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌均有一定抑制作用。

表2绵毛鹿茸草不同提取液的次生代谢产物含量与抑菌活性的相关性（略）

水平显著差异：*P<0.05，**P<0.01

3讨论

次生代谢是植物的重要特征，其产物既具有重要的生态学意义又可决定各类植物在进化过程中的兴衰成败、生死存亡等问题［9］，植物中的次生代谢产物还具有抗过敏、降血压、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种活性。

绵毛鹿茸草对70%乙醇提取液、60%丙酮提取液、水提取液对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有抑制作用，前两者为中等抑制作用，后者为弱抑制作用；70%乙醇提取液是肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌的良好抑制剂，60%丙酮提取液是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的良好抑制剂。推测对大肠杆菌和枯草杆菌的抑制作用主要由提取液中的绿原酸和蒽醌引起的。

文献查阅得知：金银花中绿原酸的平均含量为56.92g·kg-1［10］，巴戟天样品的游离蒽醌含量为的范围为0.013～0.049g·kg-1［7］。绵毛鹿茸草70%乙醇提取液中总绿原酸、游离蒽醌的含量72.752g·kg-1、0.043g·kg-1。从中不难看出：70%乙醇提取液是绵毛鹿茸草的良好提取剂。至于绵毛鹿茸草中这些次生代谢产物的分子组成、分子结构等方面内容有待进一步的研究。

【参考文献】

［1］中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第四册)［M］.北京：科学出版社，1987：97.

［2］何维明，钟章成.绞股监种群次生代谢产物的动态及其生态学意义［J］.云南植物研究，1998，20(4)：434438.

［3］李钧敏，金则新，杨蓓芬.云锦杜鹃总黄酮含量及成分分析［J］.西北林学院学报，2004，19(1)：110112.

［4］邢俊波，李萍，温德良.不同物候期金银花中总绿原酸的积累动态研究［J］.中国中药杂志，2001，26(7)：456459.

［5］王冲之，孙健，李萍.贝母类药材生物碱及生物碱苷含量测定方法学研究［J］.中国药学杂志，2003，38(6)：417418.

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［8］王莘，苏玉春，董浩，杨会敏，王建华，李金风.9种中药提取物对乙型溶血性链球菌的抑菌作用比较［J］.中草药，2004，35(3)：309310.

［9］杜近义，胡国赋，秦际威.植物次生代谢产物的生态学意义［J］.生物学杂志，1999，16(5)：910.