骨骼肌细胞脑内移植探索

脑移植是目前治疗巴金森病的重要手段之一[1，2」。这一治疗能否成功的关键是移植物能否在被移植的脑组织内长期存活并能不断表达化学递质多巴胺或其前体。因此，选择合适的组织细胞作为移植物对实现这一目标十分重要。近10余年来许多学者〔，一5」将各种不同组织细胞，如神经细胞、胶质细胞、皮肤细胞以及内分泌细胞等，植人大鼠脑内进行实验研究。现已有报道说明，移植胚胎脑组织细胞及自体肾上腺髓质细胞可在受体脑内有较长的存活期[6j。但用这些细胞进行移植，都存在一定问题川。如自体肾上腺髓质细胞移植的患者自身会受到较大打击，且细胞在脑内存活受限制;用胚胎脑移植除了受免疫排斥外，还有很大的伦理道德问题。现在发现，自体骨骼肌细胞具备作为移植物的优越性困，即:该细胞成熟后不再分裂、取材容易而对患者打击很小、培养易存活、易于接受外源性基因而容易改变遗传特点等。对于用骨骼肌细胞进行脑内移植能否存活及是否有不良影响的研究在国内尚未见报道。本研究拟将对这一问题进行探索，以求为用骨骼肌细胞进行脑内移植治疗包括巴金森病在内的神经系统疾患提供实验依据。

材料和方法

将新生2一5d的SD大鼠麻醉后取出四肢骨骼肌，剪碎，用胰酶及胶原酶共同消化后制成细胞悬液。用Percoll梯度法纯化细胞，以1xl护细胞密度放人35mm培养皿中，经过5~7d的培养，使其中的干细胞(stemeells)发育为成肌细胞(myoblasts)和肌管细胞(myotubes)。部分培养皿中，加人荧光染料Diz(3.3，一dioctadeeyloxaearboeyanineperehlorate，M.p.Ine)以供原代肌细胞吞噬并被着色。将培养的成肌和肌管细胞按2:3比例混合后[0]，以大致lx106细胞数分两点植人到体重220~2509的SD大鼠脑内一侧纹状体中，总量为15川。共移植大鼠38只，其中有4只所用移植细胞为被DII染色的肌细胞。移植后动物分别存活2周(n=6)、4周(n=8)、8周(n=8)、16周(n=8)、6个月(n一8)和12个月(n一4)，将动物经升主动脉先灌注0.lmol/L磷酸缓冲液(PBS)Zooml，再灌人0.lmol/LPBS(pH7.4)配制含4%多聚甲醛和15%蔗糖的固定液。灌注后立即取脑并作冰冻额状切片(厚20拌m)。切片分3组，一组分别用抗横纹肌动蛋白和肌红蛋白抗体(DAKOCo.I-td)孵育12一24h(4c)，并用ABc法染色(试剂盒由vector公司提供)，再用Nissl法复染。其他两组切片分别用Nissl法及HE染色。普通及荧光显微镜下观察并记录结果。另外将存活8周(n一2)及16周(n-2)的动物不经任何灌注直接断头取出脑内移植物，经胰酶消化后按上述体外培养方法重新进行培养，并观察记录其存活、生长情况。

结果

1.原代骨骼肌细胞体外培养

在倒置显微镜下观察原代骨骼肌细胞体外培养状况，发现在培养的前3d，这种细胞以成肌细胞的形式存在。细胞小，呈梭形。3d后细胞开始有排列现象，并逐渐形成管状，细胞与细胞相互融合，此期细胞称肌管细胞(图1)，有时还可见到这些细胞有轻微的收缩现象。培养细胞经用抗横纹肌动蛋白或肌红蛋白的免疫组织化学染色后发现其免疫阳性细胞数占培养细胞总数的90%以上(图2)。这些免疫阳性细胞呈明显横纹肌特征，即细胞内有多个细胞核。

2.移植区的组织学检测

2.1经免疫组织化学染色的观察:对移植后分别存活2周、4周、8周、16周及6个月的各例动物脑切片行免疫组织化学染色，结果显示全部动物移植部位均反应阳性(图3)。应用抗横纹肌动蛋白及肌红蛋白两种抗体孵育，结果无明显区别。在经Nissl方法复染的切片上，发现在存活2周的动物的移植物周围有少量胶质细胞增生，移植4周可见胶质细胞浸润有所增加。移植前经nl处理的移植物在波长4“一550nm下用荧光显微镜观察，显现强红色(图4)。随着移植后时间延长，各组动物的移植区均未见明显缩小或扩大，亦未见肿瘤形成现象。另外，在存活12个月的4例动物中，其中2例脑切片免疫组织化学染色后移植区呈阳性反应，另外2例为阴性反应。

2.2移植区组织的体外培养:对移植后8周和16周动物脑内取出的移植区组织重行体外培养，发现原代肌细胞重新生长。但这些细胞生长缓慢，早期呈梭形，到第10d后才出现细胞排列现象。12d后细胞逐渐形成肌管细胞并开始相互融合。用抗横纹肌动蛋白和肌红蛋白抗体行免疫组织化学反应，可见这些细胞呈阳性反应(图5)。

讨论

本研究结果说明，新生大鼠的骨骼肌较易于在体外培养成活，它们可在培养一周内表现出由成肌细胞转化为肌管细胞的发育过程。这与传统的认识[l0〕相一致。这些原代肌细胞植人大鼠纹状体后能存活超过6个月以上，有些可达一年，说明骨骼肌细胞是一种能在脑内长期存活的外源性细胞，这已在一些研究中得到证实叫。尽管能在脑内较长期存活，但植人的骨骼肌细胞并不在脑内繁殖而使移植区增大。这可能是由骨骼肌细胞核不含DNA而不产生有丝分裂所决定的。本研究中，存活8周与16周的移植物可被重新行体外培养，并同时再现从成肌细胞到肌管细胞的过程，说明能自我更新的骨骼肌干细胞在脑内能长时间存活，这提示被植人脑内的骨骼肌在某种情况下仍有再更新的可能。这一机制应更有助于延长骨骼肌在脑内的存活期。已有实验证明[l‘〕，植人的骨骼肌与神经组织之间可能缺少血脑屏障，这有助于选择骨骼肌作为脑内移植的细胞。还有若干实验证明[9.’2〕，在体外培养成活的骨骼肌细胞，可以被转人外源性基因并能得到较好表达。这些都说明骨骼肌细胞可能是一种非常有价值的、可作为行基因改造后作脑内移植的细胞。也就是说，骨骼肌细胞可能是基因治疗某些神经系统疾患的有用工具。smith等〔‘习曾介绍过利用肌细胞移植治疗某些肌源性疾病及代谢紊乱性疾病的成功经验。另外一些报道表明，移植原代肌细胞对受体是安全的。如Law巨“习用成肌细胞进行肌肉移植，移植物可长期存活而未发现有肿瘤形成。Huard〔‘5〕将之对人移植后，经临床追踪观察也认为是安全有效的。最近Jiao叫等也报道了将新生大鼠横纹肌细胞经转基因后，移植到大鼠脑内，可达至少6个月的存活期，本研究所见与其结果基本一致。这些结果为进一步研究对骨骼肌细胞转人外源性基因，并作脑内移植使其在脑内表达，奠定了基础。