胚胎早期发育体外共培养研究

【摘要】目的探讨共培养体系中体细胞对胚胎早期发育的影响及比较2种常用共培养体系的优劣。方法实验分3组:同种不同类型体细胞,受精卵分别在含颗粒细胞和成纤维细胞的M199培养液中培养;异种同类型体细胞,受精卵分别在含牛颗粒细胞和小鼠颗粒细胞中M199培养液中培养;2种共培养体系比较,受精卵分别在“M199+颗粒细胞”和“B2+Vero细胞”的共培养体系中培养。结果颗粒细胞组较成纤维细胞组囊胚率高(P<0.05);牛颗粒细胞组和小鼠颗粒细胞组在卵裂率和囊胚率方面差别无统计学意义;“M199+颗粒组”在卵裂率和囊胚率方面与“B2+Vero组”差别无统计学意义,但囊胚细胞数较少(P<0.05)。结论在一定的条件下,共培养体系中体细胞对胚胎早期发育有一定影响;“B2+Vero细胞”的共培养体系优于“M199+颗粒细胞”的共培养体系。

【关键词】胚发育共培养

ABSTRACT:ObjectiveTostudytheeffectofsomaticcellcoculturesystemontheearlybovineembryodevelopmentandcomparisonoftwodifferentcoculturesystems.MethodsExperiment1:thesomaticcellswereofthesamebreedbutdifferenttypes(granulecellgroupandfibroblastgroup);experiment2:thesomaticcellswereofthesametypebutdifferentbreeds(bovinegranulecellgroupandmousegranulecellgroup);experiment3:comparetwococulturesystem(M199+granulecellgroupandB2+Verocellsgroup).ResultsInexperiment1,granulecellgroupwassimilartofibroblastgroupincleavageratebuthigherinblastocystrate;inexperiment2,therewasnodifferencebetweentwogroupsincleavagerateandblastocystrate;inexperiment3,therewasnodifferencebetweentwogroupsincleavagerateandblastocystrate,buttotalcellnumberofblastocystsinB2+VerocellsgroupwashigherthanthatofM199+granulecellgroup.ConclusionSomaticcellcoculturesystemmayhaveaneffectontheearlyembryodevelopmentsomeconditions,andthecoculturein“B2+Verocells”isbetterthanin“M199+granulecells”forbovineearlyembryodevelopment.

KEYWORDS:embryo;development;coculturesystem

目前,胚胎早期发育体外培养体系可以分为合成液培养体系和共培养体系。合成液培养体系是利用成分确定的合成培养液,该体系成分明确,便于研究胚胎发育过程中每一种物质对胚胎的作用机制,但桑椹胚和囊胚发育率不高。胚胎体外共培养体系是指胚胎与体细胞一起在培养液中共同培养以促进胚胎的体外发育。共培养体系可以获得较高的囊胚发育率,而高囊胚发育率是许多科学研究和生产实践所追求和必需的。

为探索胚胎早期发育最佳的体外培养体系，特别是胚胎与体细胞共培养体系，人们已取得一定成果[1]，但仍有许多问题尚不明确。本研究以奶牛胚胎为受试对象，探讨共培养体系如何提高胚胎的囊胚发育率,体细胞的效应有无种间差异及不同类型的同种体细胞有无差异。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1胚胎

取自12只发情周期正常的青年荷斯坦奶牛(由上海滔滔v转基因有限公司提供),年龄12～13月,体质量和体况相似。

1.1.2试剂

TCM199（美国Gibco生物试剂公司）,其余试剂购自美国Sigma公司。

1.1.3分组

(1)同种不同类型体细胞:颗粒细胞组,受精卵培养全程均在M199培养液含牛颗粒细胞单层中培养;成纤维细胞组,受精卵培养全程均在M199培养液含牛成纤维细胞单层中培养。(2)异种同类型体细胞:牛颗粒细胞组,受精卵培养全程均在M199培养液含牛颗粒细胞单层中培养;小鼠颗粒细胞组,受精卵培养全程均在M199培养液含小鼠卵丘细胞单层中培养。(3)两种共培养体系比较:M199+颗粒组,受精卵培养全程均在M199培养液含牛颗粒细胞单层中培养;B2+Vero组,受精卵培养全程均在B2培养液含Vero细胞单层中培养。

1.2方法

1.2.1卵丘

卵母细胞复合体(COC)获得通过活体取卵(ovumpickup,OPU)方式获得,具体操作见文献[2]。

1.2.2卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养

参照文献[3],COC在成熟液(TCM199+10%FBS+LH10μg/mL+E21μg/mL+FSH1μg/mL)中培养23～24h。培养条件:体积分数为0.05的CO2、38.5℃、饱和湿度。使用同一公牛同一批号的冻精液进行受精,受精液为BO液,使精子的最终密度约为1×106mL-1。置CO2培养箱精卵共孵育6～8h。将受精卵按每50μL10～20个移入体外培养滴。每隔48h半量更换培养液。受精48h后计算卵裂率,第8天计算囊胚率。

1.2.3共培养体系中体细胞单层制备

牛颗粒细胞单层:从OPU收集到的检卵液中挑选光泽度好、细胞致密的颗粒细胞碎片,加入0.25%胰酶吹打1min,离心洗涤2次,体外培养液悬浮细胞,细胞长满约80％加入受精卵。

小鼠颗粒细胞单层:雌性昆明白小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG(10IU),48h后注射人绒毛膜促性腺激素HCG(10IU/),13～15h后输卵管壶腹部取卵,用透明质酸酶消化COC,收集消化下来的卵丘细胞,体外培养液离心洗涤2次,悬浮细胞,细胞长满约80％时,加入受精卵。

Vero细胞单层:用0.25%胰酶消化长至70％～80％的Vero细胞,离心洗涤2次,B2培养液悬浮细胞,细胞长满约80％时,加入受精卵。

牛成纤维细胞单层:选用2～5代的牛成纤维细胞,M199体外培养液离心洗涤2次,悬浮细胞,细胞长满约80％时,加入受精卵。

1.2.4囊胚期细胞计数

培养第8天的囊胚用5μg/mLHoechst33342溶液染色5min,用盖玻片压破胚胎,荧光显微镜下计数,每个囊胚统计3次,计算均值[4]。

1.3统计学处理

使用SAS6.12统计软件进行卡方检验和方差分析,P＜0.05为差别有统计学意义。

2结果

在同种不同类型体细胞研究中,以颗粒细胞为单层的颗粒细胞组比以成纤维细胞为单层的成纤维细胞组囊胚率较高(P＜0.05),但卵裂率两者相似(表1)。表1同种但不同类型体细胞的共培养效果（略）

在异种同类型体细胞研究中,牛颗粒细胞组和小鼠颗粒细胞组在卵裂率和囊胚率差别无统计学意义(表2)。表2异种同类型体细胞的共培养效果（略）

在两种共培养体系的研究中,M199+颗粒组虽然在卵裂率和囊胚率与B2+Vero组差别无统计学意义,但囊胚中的总细胞数较少(P<0.05,表3)。表3两种不同的共培养体系的共培养效果（略）

3讨论

3.1共培养体系的机制

共培养体系是利用体细胞在体外与受精卵共同培养,促进胚胎发育。目前,已有一些实验证明共培养体系确实能够显著提高胚胎体外早期发育的囊胚率。其主要机制可能有:(1)体细胞分泌一些促进胚胎早期发育的物质。最有可能的物质为一些生长因子,如转化生长因子α及β(TGFα和TGFβ)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子（IGF）等。Wastond等用反转录扩增法证明,在培养的体细胞中有IGF、FGF、TGFα和TGFβ的mRNA的转录。另一方面在早期发育胚胎中有生长因子受体的表达。(2)共培养细胞在降低氧压,清除氧自由基等方面发挥重要作用。共培养体系培养箱中通常用的氧浓度为空气中的20％左右,但在正常生理状况下,输卵管和子宫中氧浓度为3.5%～8.5%。研究表明，共培养能降低培养体系中的氧压和氧自由基使胚胎克服发育阻断[58]。

3.2共培养体系中同种但不同类型体细胞的研究

Goto等将牛的受精卵分别与颗粒细胞、输卵管细胞和子宫细胞在M199液中共培养,囊胚率差异不显著[9],但本实验分别用颗粒细胞和成纤维细胞同在M199共培养却得出囊胚率差异显著的结论。分析其原因可能为颗粒细胞、输卵管细胞和子宫细胞都属生殖系统细胞,在共培养时分泌的促发育物质相似,物质代谢的途径相似。而本实验中的颗粒细胞和成纤维细胞分属不同的系统,差异较大,卵丘细胞与胚胎关系密切,其分泌的物质和代谢途径更适合胚胎的早期发育,因此囊胚率较高。另外,可能与共培养细胞传代的次数也有关联。随着传代次数的增多,培养细胞的形态和功能将发生改变。本实验中的成纤维细胞为2～5代的细胞,可能在一定程度上影响成纤维细胞对胚胎发育的促进作用。

3.3共培养体系中异种同类型体细胞的研究

Eiiington等用同种或异种输卵管上皮细胞体系共培养都得到较好的结果[10],本实验用牛卵丘细胞和小鼠卵丘细胞培养牛胚胎也都得到较好的囊胚发育率,说明卵丘细胞的种间差异对牛胚胎早期发育的体外培养影响不大。但相比较而言,小鼠的卵丘细胞在生物安全性上将更有保证。因为在牛胚胎体外生产中,制备共培养单层的颗粒细胞常常是来源于屠宰场的卵巢,可能出现未知病原菌如病毒或蛋白侵染子的感染,影响胚胎的发育及附植。因此,小鼠卵丘细胞促进牛胚胎的早期发育具有一定的理论意义和实践意义。

3.4两种较常用的共培养体系

Desal等检测到了胚胎与Vero细胞共培养时Vero细胞释放的生长因子和细胞因子,包括血小板生长因子、白细胞介素6、EGF、TGFα和TGFβ等。本实验用B2+Vero细胞的共培养体系同样获得较好的囊胚发育率,并且与M199+颗粒细胞相比,囊胚细胞数较多,质量较高。此外B2+Vero共培养体系还有其独特的优势。由于B2培养液和Vero细胞都是商品化的,在来源和制备上较为容易,结果也更加稳定,更重要的是在生物安全性上也更有保证[11],因此,B2+Vero共培养体系是一种较好的胚胎早期发育体外共培养系统。

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