二至丸合桂枝汤对三阴性乳腺癌的作用

时间:2022-11-01 08:51:03

二至丸合桂枝汤对三阴性乳腺癌的作用

摘要目的:探讨二至丸合桂枝汤对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系顺铂耐药性的影响及其分子机制作用。方法:设计并合成3条缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)siRNA,分为1#siRNA组、2#siRNA组、3#siRNA组、阴性对照组及Control组分别转染,Westernblot筛选最适siRNA。同时利用药物连续诱导法筛选顺铂耐药性MDA-MB-231细胞株(MDA-MB-231/CDDP)。制备含二至丸合桂枝汤血清,MDA-MB-231/CDDP细胞株随机分为A:空白组(转染siRNA阴性对照)、B:HIF-1αsiRNA组、C:HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤组(200µg/ml含药血清)、D:HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤(200µg/ml)+顺铂(10μmol/L)组,继续培养,检测细胞活性、细胞凋亡及细胞侵袭情况。同时利用qRT-PCR和Westernblot分别检测各组细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、HIF-1αmRNA及蛋白表达情况。结果:3#siRNA组HIF-1α蛋白表达水平抑制最显著,选此siRNA用于后续研究。与A组相比,C组和D组在作用24h、48h后均可显著抑制MDA-MB-231/CDDP细胞活性(P<0.05或P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.01),且能显著抑制细胞侵袭能力(P<0.05或P<0.01),其中,D组作用效果最显著。qRT-PCR和Westernblot检测结果显示二至丸合桂枝汤与顺铂联合干预,可显著下调MDA-MB-231/CDDP细胞中VEGF、HIF-1ɑmRNA及蛋白表达。结论:二至丸合桂枝汤可通过抑制HIF-1α通路,下调VEGF表达,调控TNBC细胞系的顺铂耐药性。

关键词:三阴性乳腺癌;二至丸;桂枝汤;顺铂耐药性

HIF-1α通路三阴性乳腺癌(TNBC)靶向及内分泌治疗效果不佳,新辅助化疗方案对TNBC具有较高的缓解率和良好的预后,顺铂为首选化疗药物之一,但存在顺铂耐药性,逆转顺铂耐药性是有效治疗TNBC的潜在策略。缺氧诱导因子l(HIF-1)可促进肿瘤增殖和血管新生;HIF-1α功能性亚基与HIF-1活性水平密切相关。二至丸合桂枝汤可介导HIF-1α对TNBC细胞顺铂耐受机制进行调控,但其机制仍未阐明。基于此,本研究利用HIF-1αsiRNA转染顺铂耐药性MDA-MB-231(MDA-MB-231/CDDP)细胞株,深入探讨二至丸合桂枝汤介导HIF-1通路对TNBC细胞系顺铂耐药性的调控机制,以期为二至丸合桂枝汤的临床推广应用提供坚实的理论基础。

1材料与方法

1.1实验动物与细胞:健康SPF级SD大鼠,体质量200±30g[购于上海斯莱克动物实验有限公司,动物生产许可证号:SCXK(沪)2017-0015],饲养于杭州鹰旸生物科技有限公司动物中心,动物使用SYXK许可证号为(浙)2020-0024。适应喂养1周。转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(货号:iCell-h133,赛百慷),于含青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、5%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)的DMEM培养基培养,置于恒温培养箱中(37ºC,含5%CO2)。1.2实验试剂与仪器:二至丸合桂枝汤(女贞子、旱莲草各10g,桂枝、芍药、生姜各9g,炙甘草6g,大枣12枚,水煎至300ml,浓缩至1g/ml)。FBS(货号:11011-8615,浙江天杭生物科技);DMEM高糖培养基(货号:SH30243.01,Hyclone);CCK-8试剂盒(货号:HY-K0301,MCE);细胞凋亡试剂盒(货号:556547,BD);BCA蛋白定量试剂盒(货号:pc0020,Solarbio)。HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)、GAPDH抗体(货号:AF1009、AF5131、AF7021,Affinity)。CMaxPlus酶标仪(MD);Micro17R低温高速离心机(Thermo);C6流式细胞仪(BD);LightCy-cler®96实时荧光定量PCR(罗氏);NanodroponemRNA定量仪(ThermoScientific)。1.3HIF-1αsiRNA设计、转染与分组:合成三条Gan-kyrinsiRNA和一条对照siRNA,具体序列如下:1#siRNA组(5'-GCUGGAGACACAAUCAUAUTT-3’);2#siRNA组(5'-AGGAAGAACTATGAACATAAA-3');3#siRNA组(5'-TACGTTGTGAGTGGTATTATT-3');阴性对照组(5'-UUCUCC-GAACGUGUCACGUTT-3')。将HIF-1αsiRNA和Lipo-fectamine™2000转染试剂在OptiMEM介质中按照siRNA∶聚合物为1∶1(w/w)制备复合物。在50nMsiRNA浓度下向细胞中加入配合物;细胞在50%~60%融合时转染siRNA复合物。同时设置Control组,不做处理。1.4MDA-MB-231/CDDP细胞株建立:顺铂连续诱导法筛选耐药细胞株。MDA-MB-231细胞系取对数生长期接种于DMEM培养液(含顺铂+10%FBS),0.01、0.1、0.5、1、5、10μmol/L的顺铂逐渐诱导,48h后换培养液,每2~3d传代1次,诱导6个月获得细胞株。1.5制备二至丸合桂枝汤血清:20只SD大鼠随机分为两组,正常组:蒸馏水;给药组:8.5g·kg-1·d-1二至丸合桂枝汤,灌胃7d。腹主动脉收集5ml血标本,合并清液,灭活。微孔滤膜滤过,于-80℃冰箱保存。1.6给药处理实验分组:MDA-MB-231/CDDP细胞株在10%FBS的DMEM高糖培养基培养。细胞随机分为A:空白组(转染siRNA阴性对照)、B:HIF-1αsiRNA组、C:HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤(200µg/ml含药血清)组、D:HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤(200µg/ml)+顺铂(10μmol/L)组,培养48h。1.7Westernblot:分离目标蛋白,SDS-PAGE电泳,转PVDF膜,先后加一抗和二抗孵育,免疫印迹反应结束后,化学发光仪显影。1.8CCK-8检测:根据“1.6”细胞分组,培养对数生长期细胞悬液,加入10μl/孔CCK-8试剂,而后于450nm处测定吸光度值,计算细胞活性。1.9流式细胞术:于6孔板接种对数生长期细胞,细胞浓度调至1×106/ml。添加500μl结合缓冲液,上清液离心并添加100μl结合缓冲液。之后分别加入5μl和10μlPI的膜AnnexinV-FITC。室温下反应15min,加入400μl结合缓冲液,1h内检测细胞凋亡率。重复3次。1.10Transwell细胞侵袭:将5×104个细胞接种在Transwell上部隔室的无血清培养基中,并在下部隔室中添加含10%FBS的DMEM培养基。24h后棉签擦拭基质胶和上部隔室的细胞,4%多聚甲醛固定10min,PBS洗3次,0.1%结晶紫染色30min。倒置显微镜观察。重复3次。1.11qRT-PCR检测:按试剂盒操作说明,加Trizol提取各组细胞总mRNA,mRNA质量检测完毕后,逆转录合成cDNA,cDNA为模板,特异性扩增VEGF、HIF-1α,GAPDH为内参。VEGF及HIF-1αmRNA表达量应采用2-△△Ct方法计算。各引物序列见表1。

2结果

2.1HIF-1α蛋白表达在不同siRNA下的影响:利用Westernblot筛选合适的HIF-1αsiRNA转染用于后续实验。由图1,在MDA-MB-231细胞中,相比Control组,2#、3#siRNA组的HIF-1α蛋白表达水平显著降低(P<0.01),且3#siRNA抑制效果比2#siRNA更好,因此后续实验选择3#siRNA进行转染。图1不同siRNA对MDA-MB-231细胞中HIF-1α蛋白表达情况2.2MDA-MB-231/CDDP细胞活性在二至丸合桂枝汤联合用药下的影响:由图2,作用24h、48h后,与A组相比,C组和D组细胞活性均显著降低(P<0.05或P<0.01)。图2MDA-MB-231细胞活性变化情况(-x±s,n=6)2.3二至丸合桂枝汤联合用药对MDA-MB-231/CDDP细胞凋亡的影响:由图3,与A组相比,各组别细胞凋亡率均有一定程度的升高,其中,D组促进细胞凋亡效果最好,凋亡率最高。2.4二至丸合桂枝汤联合用药对MDA-MB-231/CDDP细胞侵袭能力的影响:由图4,各给药组不同程度地抑制细胞侵袭。与A组相比,细胞侵袭能力显著降低(P<0.05,P<0.01)的是C和D组MDA-MB-231/CDDP,且D组抑制细胞侵袭能力最显著。2.5MDA-MB-231/CDDP细胞中VEGF、HIF-1αmRNA及蛋白表达在二至丸合桂枝汤联合用药下的影响:由图5可知,与A组相比,VEGF、HIF-1αmRNA表达均显著降低(P<0.05或P<0.01),在各干预组MDA-MB-231/CDDP细胞中,C组、D组细胞中HIF-1α、VEGF蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01),其中,降低程度最明显的是D组细胞中HIF-1α、VEGFmRNA及蛋白表达。

讨论

TNBC在中医学属“奶岩”“乳岩”等范畴,病位在乳房,病根在肝肾,治疗的关键在于补肾益肝、调理阴阳。临床研究发现,二至丸合桂枝汤可通过上调5-羟色胺、抑制素B水平,有效改善绝经前Luminal型乳腺癌患者的临床症状[1]。研究表明,HIF-1αsiRNA通过Westernblot筛选而来,从结果得出,受到明显抑制的是位于3#siRNA组MDA-MB-231细胞中的HIF-1α蛋白表达,故选用3#siRNA组HIF-1αsiRNA进行转染。CCK-8检测结果作用24h、48h后,D组可显著抑制细胞活性且效果最好,提示二至丸合桂枝汤联合顺铂可有效抑制MDA-MB-231/CDDP细胞活性,有效改善MDA-MB-231/CD-DP细胞的耐药性。HIF-1可调节氧代谢,HIF-1α在多种肿瘤中表达高[2]。乳腺癌细胞耐药形成过程中HIF-1α意义特殊,利用HIF抑制剂共同给药可逆转耐药。此外,VEGF在多种肿瘤疾病中作用显著,可促进肿瘤血管新生和癌细胞增殖[3]。研究发现,VEGF受HIF-1α调控,可促进VEGF表达,提高肿瘤细胞适应缺氧微环境,进而利于癌细胞的生长浸润与迁移[4]。研究指出[5],通过抑制HIF-1α/VEGF信号传导途径,可提高多西他赛的化学敏感性,抵抗转移性去势抵抗性前列腺癌的进程。各干预组均可在一定程度上降低MDA-MB-231/CDDP细胞中VEGF、HIF-1ɑmRNA及蛋白表达,且D组降低程度最显著,证实二至丸合桂枝可介导HIF-1α通路,下调VEGF表达,逆转顺铂耐药性,加大顺铂对TNBC的治疗效果。HIF-1α还可活化促凋亡分子,拮抗抑凋亡分子,参与细胞凋亡[6]。研究结果证实,介导HIF-1α途径抑制VEGF表达量,可促进卵巢癌细胞凋亡。各干预组均可上调MDA-MB-231/CDDP细胞凋亡率,而HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤+顺铂组凋亡率最高,证实二至丸合桂枝汤可增加MDA-MB-231/CDDP细胞对顺铂的敏感度,通过抑制HIF-1α表达,然后加快细胞凋亡。综上,二至丸合桂枝汤可通过抑制HIF-1α通路,下调VEGF表达,调控TNBC细胞系的顺铂耐药性。

作者:杨慧芬 毛娟娟 单位:杭州市中医院 宁波市中医院