羟基磷灰石涂层材料制备论文

〔摘要〕目的：观察含镧羟基磷灰石作为涂层材料的细胞相容性。方法：将原代培养的成骨细胞接种到涂层表面，采用细胞计数观察第1、7、14、21天细胞在材料表面的附着、增殖情况，采用SEM观察细胞在材料表面的形态变化，并且对21d内细胞的碱性磷酸酶活性进行检测。结果：成骨细胞在材料表面的细胞增殖数与对照组间无显著性差异，细胞在材料表面伸展良好，粘附牢固，并具有良好的细胞形态及增殖率，碱性磷酸酶活性逐渐增加。结论：含镧羟基磷灰石涂层材料具有良好的细胞相容性。

关键词镧；羟基磷灰石类；涂层；成骨细胞；碱性磷酸酶

钛合金表面的生物陶瓷涂层以其优良的生物学性能已作为种植体材料广泛应用于临床，目前常用的涂层材料为羟基磷灰石（HA），但已有文献报道由于涂层工艺及HA稳定性的问题，使HA涂层在体内迅速溶解而导致种植体的失败〔1,2〕。本研究在HA中添加了稀土元素镧，使其晶体更加稳定〔3〕，同时采用新的涂层工艺，使其在钛合金表面形成稳定和牢固的涂层。在对该涂层材料的细胞毒性进行研究的基础上〔4〕，为进一步观察用含镧羟基磷灰石涂层后材料的细胞相容性，本实验在体外研究了该涂层材料与成骨细胞间的相互作用，为进一步的体内研究提供了理论和实验依据。

1材料与方法

1.1含镧羟基磷灰石涂层材料的制备

在直径为10mm，厚1.5mm的钛表面制备含镧羟基磷灰石涂层材料La-HA（西安交通大学金属材料强度实验室提供），将涂层圆片用体积分数(φ)为75%乙醇超声振荡清洗后，再用三蒸水超声振荡清洗3遍，烘干，60Co辐射灭菌后备用。

1.2成骨细胞的培养

本实验应用的成骨细胞来自大鼠颅盖骨，其培养方法见文献〔4〕。

1.3细胞在材料表面附着、增殖

将La-HA涂层圆片放入24孔板内，加入1ml的DMEM培养液浸泡24h后，将细胞接种于材料表面，浓度为5×107/L。无涂层圆片的培养板作为对照组（Con）；37℃，φ(CO2)=5%的条件下用矿化液（含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L维生素C的DMEM培养液）培养21d，细胞分别在接种后第1、7、14和21天用0.25g/L胰酶0.3ml消化15min,再加0.7ml的DMEM终止消化，充分吹打后，收集消化液。定量后在倒置显微镜下进行细胞计数，每组重复3次，取平均值。

1.4细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性

将上述实验中各时间段的细胞悬液离心、弃上清，加入体积分数为0.3%Triton-X100100μl，4℃过夜，将其移入96孔板内，再加入100μl碱性磷酸酶底物液，37℃孵育40min，加入50μl的1mol/LNaOH终止反应，在酶联免疫仪上用410nm波长测吸光度（A），统计分析。

1.5细胞在材料表面的形态学观察

将培养至第1、7、14、21天的涂层圆片分别取出，用0.01mol/L的PBS（pH7.4）洗3遍，体积分数为0.3%戊二醛固定，乙腈梯度脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜观察。

2结果

2.1细胞在材料表面的附着与增殖

图1显示出第1、7、14、21天成骨细胞在材料表面附着及增殖的数量统计。可以看出成骨细胞在材料表面附着及增殖情况良好。第21天细胞增殖的数量几乎是第1天细胞附着数量的6倍。各时间段材料表面的细胞数量与对照组之间无显著差异（P≥0.05）。

2.2细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性

通过测量成骨细胞分泌的碱性磷酸酶活性的相对强弱来表示成骨细胞在材料表面的功能。从第7、14、21天测试的碱性磷酸酶的吸光度（A）（图2）可以看出随着培养时间的增加碱性磷酸酶的活性逐渐增强，各时间点与对照组之间无显著差异（P≥0.05）。

图1成骨细胞在材料表面附着及增殖数

图2成骨细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性

2.3成骨细胞在材料表面形态学观察

图3显示扫描电镜下第1、7、14、21天成骨细胞在材料表面的形态。细胞接种在材料表面的第1天（图3a）伸展良好，多个细胞突起牢固附着在材料表面。培养至第7天（图3b）细胞突起伸展到材料表面的颗粒间，胞浆伸展并包裹材料表面的颗粒，在细胞表面也有磷酸钙颗粒形成。第14天（图3c）细胞分泌基质并连接成网状，牢固附着在材料表面及颗粒间。第21天（图3d）细胞分泌的细胞外基质更加丰富，贯穿于材料的颗粒间，材料表面也有再结晶形成。

图3扫描电镜下成骨细胞在材料表面的形态学观察

3讨论

含镧的羟基磷灰石是本实验室新研究合成的钙磷陶瓷材料。在对其理化性能及细胞毒性进行研究的基础上，将其作为涂层材料进行应用基础研究，对发展和完善种植材料具有重要意义。本实验研究将成骨细胞接种在材料表面，使植入材料与骨组织的主要功能细胞--成骨细胞相接触，不仅可以考察材料对细胞的影响，而且有助于考察材料与细胞间的相互作用，从更深层次探讨材料-细胞界面结合机制，使其结果与体内实验更加吻合。

细胞在材料表面的附着是成骨细胞在材料表面发挥功能的前提。体外观察成骨细胞与材料间的反应是有益的，因为体外实验研究可以较容易观察材料对细胞附着生长的影响，而不易受到其他系统因素的影响〔5，6〕。本实验研究即采用体外实验研究的方法，观察到成骨细胞可以在含镧羟基磷灰石涂层材料表面附着并增殖良好。扫描电镜观察可以看到成骨细胞在该涂层材料表面伸展良好并牢固附着在材料表面，细胞突起伸展到材料表面的颗粒间，并且随着培养时间的延长，细胞分泌大量细胞外基质并连接成网。同时在材料表面及细胞表面有新的钙磷结晶形成。这说明成骨细胞与该涂层材料间具有良好的相容性。同时本实验还对成骨细胞在材料表面的功能进行了研究。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的主要特征酶之一，以往常用检测碱性磷酸酶活性来鉴别成骨细胞〔7〕，观察成骨细胞的功能。本实验结果表明随着细胞的增殖，碱性磷酸酶的活性逐渐增强，说明成骨细胞在该涂层材料表面能发挥良好的功能。通过以上实验研究可以初步认为含镧羟基磷灰石作为涂层材料具有良好的细胞相容性。进一步的工作需结合体内种植实验观察来综合评价该涂层材料的应用前景。■

国家自然科学基金资助项目：59872026

作者单位：张玉梅（西安交通大学金属材料强度国家重点实验室710049）

傅涛（西安交通大学金属材料强度国家重点实验室710049）

徐可为（西安交通大学金属材料强度国家重点实验室710049）

王勤涛（第四军医大学口腔医学院）

参考文献

［1］NancollasGH,TuckerBE.Dissolutionkineticscharacterizationofhydroxyapatitecoatingsondetalimplants.JOralImplant，1994，20:221

［2］LewandowskiJA,JohnsonCM.Structuralfailureofosseointegratedimplantsatthetimeofrestoration.Aclinicalreport.JProsthetDent,1989，62:127

［3］张玉梅，傅涛，徐可为.含镧羟基磷灰石的合成及性能研究.牙体牙髓牙周病学杂志，2000,10(3):149

［4］张玉梅，傅涛，徐可为.含镧羟基磷灰石的细胞毒性研究.牙体牙髓牙周病学杂志,2000,10(3):152

［5］MatsudaT,DaviesJE.Theinvitroresponseofosteoblaststobioactiveglass.Biomaterials，1987，8:275

［6］VillanuevaJE.NimniME.Modulationofosteogenesisbyisolatedcalvariacells:Amodelfortissueinteractions.Biomaterials，1990，11:13

［7］AttawiaMA.UhrichKE,BotchweyE.etalCytotoxicitytestingofpoly(anhydride-co-imides)fororthopedicapplications，JBiomedMaterRes,1995,29:1233