ＲPA技术在结核分枝杆菌诊断的应用

摘要:目的传统的结核分枝杆菌鉴定方法周期时间长、敏感性较差，往往延误患者的诊断和治疗，随着分子生物学的飞速发展，为了可以快速诊断结核分枝杆菌，本研究利用重组酶聚合酶扩增(ＲecombinasePolymeraseAmplification，ＲPA)技术建立快速的结核分枝杆菌检测方法，为结核病患者的诊断和治疗赢得宝贵时间。方法应用ＲPA技术对疑似肺结核患者痰标本中的特异性核苷酸片段进行检测，利用卫生统计学检验ＲPA技术与传统诊断方法有无差异。结果80例疑似肺结核患者的痰标本中检测出70例阳性，有10例排除结核病。80例疑似肺结核患者的痰标本中，ＲPA技术检测阳性率为87.50%，痰涂片检测阳性率为56.25%，痰培养检测阳性率为75.00%，ＲPA技术检测阳性率较高，与痰涂片、痰培养比较，差异均有统计学意义(χ2=25.00，P＜0.01;χ2=10.00，P＜0.01)。结论ＲPA技术的成功建立对结核病的快速诊断有着重要意义。

关键词:重组酶聚合酶扩增;结核分枝杆菌;特异性;诊断;检测

结核病(tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacte-riumtuberculosis，MTB)引起的一种古老的慢性传染病，以肺部感染最为常见［1］。2019年世界卫生组织统计，全球报告结核病患者710万例，与估算的1000万例有所差异，可能与大部分患者未被诊断出来有关［2］，可见结核病的诊断存在一定的难度。肺结核是结核病中具有传染性的一类，临床上对这类患者的诊断主要通过痰涂片法和痰培养法，按照世界卫生组织的统计，临床上的诊断率只有不到70%。由于部分患者未得到及时诊断，使其成为持续的传染源，发病数持续增加。基于此，需改进现有的诊断方法，以提高结核病的诊断率。重组酶聚合酶扩增(ＲecombinasePolymeraseAmplification，ＲPA)技术被称为是可以替代PCＲ技术的核酸检测技术［3－7］。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域［8－11］。本研究利用ＲPA技术建立结核分枝杆菌的快速检测方法，现报告如下。

1材料与方法

1.1材料结核分枝杆菌标准株H37Ｒv由中国疾病预防控制中心提供，该研究涉及的菌株标本和痰标本均来源于邯郸市第六医院;引物与探针(表1)交由上海生工有限公司合成;DNA提取采用江苏硕世公司的磁珠提取试剂盒，ＲPAMasterMix购自潍坊安普未来生物科技有限公司，培养基选用珠海贝索的酸性罗氏培养基和中性罗氏培养基。1.2仪器西安天隆Ｒeal－timePCＲ仪，江苏硕世全自动核酸提取仪，热电培养箱。1.3方法1.3.1痰涂片镜检抗酸染色［12］，用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2～3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3～5min，待标本冷却后用水冲洗。3%盐酸酒精脱色30s～1min，用水冲洗。用碱性美兰溶液复染1min，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。1.3.2分离培养取目标痰液经4%氢氧化钠溶液消化处理15min后，酸性罗氏培养基37℃培养7周，分离得到菌株。1.3.3DNA制备取1ml菌悬液或痰液于1.5ml离心管中，7500rpm离心10min，弃上清，加入180μl溶有溶菌酶的缓冲液BL，充分混匀，低速离心，于37℃水浴温育30min(温浴期间每隔10min颠倒混匀一次)。加入10μl蛋白酶K至样品中，充分混匀，低速离心，56℃水浴温育10min。将消化液全部加入到试剂板AT中的第1、7列中。将加入样本的试剂板AT放置在核酸提取仪中，试剂板AT的缺口朝外。插入八联磁棒套，关上试验仓，按下设置核酸提取程序，并选择运行。1.3.4ＲPA反应体系每份反应液中含有A反应液29.4μl，上、下游引物(10μmol/μl)各2μl，探针(10μmol/μl)2μl，灭菌水11.5μl，结核分枝杆菌DNA样品2μl，反应液总体系50μl。1.3.5PCＲ反应条件39℃30s(×1)，39℃10s→39℃20s(×40)。1.3.6结果分析采用SPSS21.0对数据进行整理分析，采用χ2检验对不同检测方法的结果进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1ＲPA技术检测结果80例疑似肺结核患者的痰标本中检测出70例阳性，结果见图1。对余下的10例患者标本分别进行痰涂片以及痰培养，结果均为阴性，又对10例患者进行流行病学调查，综合实验结果可以排除结核病的可能。2.2痰涂片镜检结果对80例疑似肺结核患者的痰标本进行痰涂片镜检，阳性45例，再进行ＲPA检测，45例患者标本全部阳性;对35例涂片阴性的标本进行ＲPA检测，其中检出25例阳性、10例阴性。在80例疑似肺结核患者的痰标本中，ＲPA检测阳性率为87.50%，痰涂片检测阳性率为56.25%，ＲPA阳性检测率较高，对两种检测方法进行配对设计的χ2检验，差异有统计学意义(χ2=25.00，P＜0.01)。2.3痰培养结果80例疑似肺结核患者的痰标本中培养出60株结核分枝杆菌。与ＲPA技术比较见表3。60例培养阳性的标本进行ＲPA检测，全部阳性，对20例痰培养阴性的标本进行ＲPA检测，其中检出10例阳性、10例阴性。在80例疑似肺结核患者的痰标本中，ＲPA检测阳性率为87.50%，痰培养检测阳性率为75.00%，ＲPA阳性检测率较高，对两种检测方法进行配对设计的χ2检验，差异有统计学意义(χ2=10.00，P＜0.01)。

3讨论

肺结核患者传统诊断方法主要有细菌学、免疫学和分子生物学。细菌学的临床诊断是传染性肺结核患者诊断的金标准，其中主要的诊断方法有痰涂片的抗酸染色法和结核分枝杆菌培养法。然而，痰涂片抗酸染色法的阳性率很低，阳性率低的原因主要受痰标本质量好坏的影响，因此阳性率的差别很大。细菌分离培养法的阳性率稍高于痰涂片抗酸染色法，并且能够分离得到活菌，但结核分枝杆菌的生长速度缓慢，检测周期较长，一般需要7周左右。随着PCＲ技术突飞猛进的发展，该技术被广泛应用于临床实验室诊断之中，具有灵敏、快速、特异的特点，能够快速检测不同类型的标本中的少量细菌，灵敏度较高，而且不受抗生素使用的影响。但PCＲ技术无法避免地要经历变性、退火、延伸等热循环步骤，并且需要具备昂贵的PCＲ扩增仪器才能实现核酸扩增，因此限制了其在基层单位以及现场简陋条件下的应用，加之扩增时间长、成本高，并不适合传染病的现场检测和床旁诊断［13］。目前Gene－XpertMTB/ＲIF技术已被应用在结核病的诊断中，虽然可以提高诊断率，但该技术设备昂贵并且通量小，试剂封闭且较贵，并未得到很好的应用推广。因此，研究和发展一种快速高效、操作简便、灵敏可靠的检测技术，对传染病的诊断、治疗和疫情的控制具有重要意义。ＲPA技术是一种新型的等温扩增技术，是目前全球较新的等温扩增检测技术，其对硬件设备的要求很低，尤其可以应用于传染病的分子诊断中［14－17］，且检测时间短，只需5～20min就可以完成［18－20］。

作者：黄亮 胡朝辉 闫永飞 高腾 许梦捷 李伟昊 赵丽萍 单位：邯郸市疾病预防控制中心