HLA测序技术应用论文

【摘要】1998年6月至2004年7月，广州脐血库向国内21家移植中心54例患者提供了非亲缘性异基因脐血。为了探讨非亲缘性脐血移植供/受者HLA等位基因及其亚型与脐血移植GVHD发生率的关系，对54例非亲缘性脐血移植病例中，半年后有反馈随访资料的48例，利用盐析或柱提法提取移植的非亲缘性脐血的DNA及移植病例的全血DNA，采用HLA-SBT方法分别对HLA-A、B、DRB1位点进行了高分辨分型，并与我库脐血收集常规采用的HLA-SSP（HLA-Sequencingspecificprimers）低分辨结果进行了比较分析。结果发现，HLA不合位点不多于2个和HLA不合位点不少于3个的病例GVHD的发生率具有统计学显著性差异（P<0.05）。在对HLA-A、B、DRB1等位基因高分辨单因素分型结果中，HLA-B和HLA-DRB1等位基因匹配全相合的病例GVHD发生率显著低于不完全相合病例GVHD的发生率（P=0.000，P=0.005）。结论：PCR-SBT技术在非亲缘性脐血移植HLA配型方面具有重要的临床应用价值。

【关键词】非亲缘性脐血移植；HLA配型;HLA测序技术；HLA-SBT；脐血

ClinicalApplicationofHLASequencinginUnrelatedUmbilicalCordBloodTransplantation

AbstractFromJune1998toJuly2004,Guangzhouumbilicalcordbloodbankprovidedunrelatedumbilicalcordbloodfor54patientstomorethan21transplantationcenters.HLAsequencing-basedtyping(SBT)wasusedtore-analyzetheresultsofHLAantigensandallelessoastoinvestigatetherelationshipbetweenHLAallelesandGVHD.Theinformationabout48outof54patientswasobtainedafter6monthsoffollowup.SBTwasusedtoidentifyHLA-A,B,DRB1allelesin48patientsreceivedtheunrelatedumbilicalcordbloodunits,andtheobtainedresultswerecomparedwiththeresultsofHLA-SSPLowResolutionTyping.TheresultsshowedthatthedifferenceofGVHDincidencebetweenlessthan2mismatchedHLAsitesandlessthan3siteswasstatisticallysignificant(P<0.05).Intheresultsfromsinglefactoranalysisandhigh-resolutiontypingofHLA-A,BandDRB1alleles,themismatchbetweenHLA-BandHLA-DRB1alleleswasfoundtobeasignificantfactorfortheoccurenceofGVHD.ItisconcludedthatSBTplaysanimportantroleinumbilicalcordbloodtransplantation,andtheincidenceofGVHDishigherinthetransplantationwithHLA-DRB1allelesmismatching.

Keywordsunrelatedumbilicalcordbloodtransplantation;HLAmismatch;HLAsequencing;HLAsequencingbasedtyping;umbilicalcordblood

HLA高分辨分型技术不仅可以对HLA血清学配型起到积极的校正作用，对研究哪些HLA等位基因相合可以明显减弱GVHD，哪些等位基因不相合可以耐受等方面以及制定相对个体化的HLA配型策略都具有重要的临床应用价值。在骨髓造血干细胞移植中，HLA测序分型技术得到了广泛的应用和发展，在预防GVHD方面具有十分重要的意义。本研究采用以测序为基础的HLA分型技术（HLA-sequencingbasedtypingHLA-SBT）对可随访的48例非亲缘性脐血移植病例HLA配型结果进行回顾性分析，以探讨HLA-A/B/DRB1等位基因匹配程度对非亲缘性脐血移植GVHD的影响。

材料和方法

脐血来源

脐血样本全部来自广州脐血库，脐血分离、冷冻、保存以及相关检测参考相关文献［2］。

移植供受体选择

54例非亲缘性脐血移植供受者样本及随访资料由国内21家移植中心提供，其中6例待随访，选择48例非亲缘性脐血移植病例进行回顾性分析，移植受者一般情况见表1。Table1.Generalcharacteristicsof48UCBTrecipients（略）

急性移植抗宿主病（aGVHD）的预防

48例移植病人均采用环孢霉素甲基强的松龙方案预防aGVHD。

移植供/受体的DNA提取

移植供/受体DNA提取均采用G&TDNA提取试剂盒。

HLA-SSP分型

采用OneLambda公司的HLA-SSP分型试剂盒、PE9700PCR仪进行分型，采用OneLambda公司提供的HLA分型格局表判读结果。

HLA-SBT分型

应用ABIPRISM3100型测序仪进行分型。DNA4μl与PCRMix（Forensic公司提供）16μl混合，再加入金牌酶0.3μl进行扩增反应。PCR条件如下：95℃10分钟；96℃20秒，60℃30秒，72℃3分钟，36个循环；4℃forever。取PCR产物5μl在2%琼脂糖凝胶中电泳，确定是否扩增。向PCR产物中加入3μlExoSAP-IT,进行消化反应：37℃20分钟，80℃15分钟。消化后产物与SequencingMix混合后，进行测序反应：96℃20秒，60℃2分钟，共25个循环。测序反应产物用NaOAc/EDTA去除多余的SequencingMix，并用100%及80%EtOH沉淀和纯化DNA。加入15μl甲酰胺，置于ABTPrism3100测序仪中进行电泳。利用MatchTools及MTNavigator软件对电泳结果进行分析，得出HLA高分辨配型结果。

统计学分析

数据用SPSS10.0统计软件包处理，行chi-squaretest分析。结果

PCR-SBT技术分型

48例非亲缘性脐血移植供受者HLA-A/B/DR采用PCR-SBT技术分型全部成功，SBT分型结果在低分辨水平（HLA基因型星号后2位数）与SSP分型结果完全一致。48例非亲缘性脐血移植供受者中，HLA等位基因6/6相合4例（8.3%），5/6相合37例（77.1%），4/6相合7例（14.6%）；HLA等位基因亚型匹配5/6相合5例（10.4%），4/6相合16例（33.3%），3/6相合19例（39.6%），2/6相合8例（16.7%），未发现HLA等位基因亚型配型全相合病例。

SBT分型结果与GVHD发生率

48例非亲缘性脐血移植供/受者HLA等位基因分型结果中，HLA等位基因匹配6/6、5/6和4/6位点相合的移植受者GVHD分别发生4/4例、18/37例（48.6%）和5/7例（71.4%），统计分析（chi-squaretest），HLA匹配程度与GVHD发生率之间无统计学差异（P>0.05）。48例非亲缘性脐血移植受者中，植入33例，HLA等位基因亚型匹配5/6相合的2例移植病例均未发生GVHD，而4/6、3/6、2/6位点相合的移植病例GVHD发生率分别为54.5%（6/11）、91.7%（11/12）和75.0%（6/8），统计分析（chi-squaretest），HLA等位基因亚型不合位点不多于2个和HLA不合位点不少于3个的病例GVHD发生率具有统计学显著性差异（P<0.05）。在HLA-A等位基因亚型分型结果中，HLA-A等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2相合病例分别为11、28和9例，GVHD发生率分别为27.3%（3/11）、57.1%（16/28）和55.6%（5/9），统计分析未发现HLA-A等位基因亚型匹配完全相合与不完全相合GVHD发生率具有统计学显著差异（P=0.061）（表2）。Table2.RelationshipbetweenHLAmismatchandoccurrenceofGVHDin48UCBTrecifients（略）

在HLA-B等位基因亚型分型结果中，HLA-B等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2位点相合病例分别为11、33、4例，GVHD发生率分别为72.7%（8/11）、45.5%（15/33）和50%（2/4），统计分析未发现HLA-B等位基因亚型匹配完全相合与不完全相合GVHD发生率具有统计学显著差异（P=0.000）（表2）。在HLA-DRB1等位基因亚型分型结果中，HLA-DRB1等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2位点相合病例分别为16、25和7个，其GVHD发生率分别为25%（4/16）、64.0%（16/25）和71.4%（5/7）。统计分析发现，HLA-DRB1等位基因亚型相合与否与GVHD发生率具有强相关性（P=0.003）（表2）。在38例HLA-DRB1等位基因全相合病例中，HLA-DRB1等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2位点相合病例分别为16、18和4个，GVHD发生率分别为25%（4/16）、61.1%（11/18）和50%（2/4）；经统计学分析，比较HLA-DRB1等位基因亚型相合与不相合与GVHD发生率具有显著的统计学相关性（P=0.008）。

与GVHD相关的HLA等位基因亚型

在本回顾性研究中，HLA-A常见等位基因型为HLA-A*02、A*11和A*24，HLA-B常见等位基因型为HLA-B*15、B*40和B*46，HLA-DRB1常见等位基因型为HLA-DRB1*09、DRB1*12和DRB1*15（表3）。

Table3.HLA-A/B/DRB1matchingandoccurrenceofGVHDbyPCR-SBT（略）

剔除两点不合的样本，选择受体与供体一个位点相合而另一位点不合的病例，比较其GVHD发生率。HLA-A*02、A*11和A*24基因型分别有19例、21例和13例；HLA-B*15、B*40和B*46基因型分别有20例、13例和14例；HLA-DRB1*09、DRB1*12和DRB1*15基因型分别有11例、10例和13例（表3）。经统计分析，HLA-A*11匹配与不匹配样本GVHD发生率分别为28.6%和64.3%，HLA-B各等位基因型匹配情况GVHD发生率未见明显差异，HLA-DRB1*12相合3例病例均未发生GVHD，而不相合的7例病例中有2例发生了GVHD。经统计分析（chi-squaretests）HLA-A/B/DRB1各个等位基因匹配程度与GVHD发生率未见统计学相关性。

讨论

有研究表明，单个等位基因的不匹配（如白种人HLA-A*0201和HLA-A*0205亚型）可以引起严重的GVHD；也有报道DRB1等位基因不同与GVHD之间存在强相关性，而且DRB1不合与存活期缩短密切相关［2］。但是现在的研究表明，并不是所有等位基因不同与它的不相合是一致的，有些HLA等位基因的不相合是可以耐受的。在Nicholson等［3］对HLA-DP抗原的报道中，采用混合淋巴细胞培养（mixedlymphocyteculture,MLC）方法观察到最强烈的MLR反应与DPB1*0301和DPB1*0201有关，低MLR与DPB1*0401和DPB1*0402有关。提高HLA基因分型的分辨率，有助于寻找HLA完全相合的造血干细胞供者，也有助于针对供、受间HLA差异程度制定相应的防治策略。因此，有人提出界定供、受者HLA相合的标准。找出究竟哪些HLA基因座位（及其产物）在决定异基因造血干细胞移植预后中起关键作用，哪些HLA（等位基因）型别不相合为临床所容许，甚至可能对病例的预后有益［9］。本研究采用HLA-SBT方法对48例非亲缘性脐血移植供/受体HLA等位基因亚型进行分析，HLA低分辨配型结果中，HLA等位基因匹配程度与GVHD发生率无显著统计学相关性。对HLA-A、B、DRB1等位基因亚型分别进行统计分析发现，HLA-B和HLA-DRB1等位基因亚型完全相合和不相合的病例GVHD发生率具有非常显著的差别。需要特别指出的是，在本研究结果中，HLA不相合等位基因亚型不多于2个和HLA不相合位点不少于3个的病例GVHD的发生率差异具有统计学显著性（P<0.05）。以上结果从两方面给我们以提示：①HLA等位基因亚型水平的匹配对预防GVHD具有积极的作用；②一定存在某些HLA等位基因亚型，其相合与否对脐血移植病例来说在某种程度上是可以耐受的。从结果中我们可以看到，在HLA高分辨配型结果中，HLA-B和HLA-DRB1等位基因亚型匹配与否与GVHD发生率具有强相关性（P=0.000，P=0.003）。HLA-A等位基因亚型匹配全相合病例GVHD发生率（27.3%）明显低于HLA匹配不全相合病例(59.4%)。这说明在非亲缘性脐血移植中，采用高分辨方法进行HLA-B和HLA-DRB1配型可以明显减弱GVHD的发生率。由于样本数较少，因此对以上结论仍然需要进行随访分析。从本结果中可以推测，HLA等位基因匹配与否对非亲缘性脐血移植者GVHD的发生具有重要作用，脐血移植者GVHD的发生率低，究其原因可能与脐血中免疫细胞的抗原性低有关。因此，非亲缘性脐血移植时对HLA采用高分辨分型是有必要的。本研究的另一个目的是试图寻找出与GVHD发生密切相关的HLA等位基因型，但由于病例数较少，无法对HLA所有等位基因型在非亲缘性脐血移植的作用进一步深入分析。我们选择了HLA-A/B/DRB1位点中比较常见的亚型进行统计分析，从统计结果中我们未发现与GVHD具有明显相关性的等位基因型。在本研究结果中，HLA-A*11等位基因相合病例的GVHD发生率（25%）明显低于不相合病例的GVHD发生率（58.3%），由于病例数少，无法进一步分析HLA-A*11等位基因亚型对GVHD的影响。但我们可以设想，如果将来在移植前HLA复核时对HLA-A11采用HLA高分辨方法，可能会降低移植后GVHD发生率。虽然我们发现HLA-DRB1等位基因与GVHD发生率具有强相关性，但是我们未能找到与GVHD明显相关的等位基因亚型，其原因也是由于病例数太少的缘故。

致谢：感谢中山医科大学孙逸仙医院、广州市第一人民医院、广州市妇婴医院、北大人民医院、北京儿童医院、安徽省立医院、河南省肿瘤医院、南方医院、暨大华侨医院、第四军医大学西京医院、第二军医大学长海医院、广东省人民医院、四川大学华西医院、上海儿童医学中心、北大深圳医院、海口市人民医院、广州市第十二人民医院、佛山人民医院和广东省117医院给予的支持和协作。

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