阅读次数:人次

恒温扩增技术的原理与用途探究

  • 1.VIP俱乐部
  • 2.查看资料
  • 3.订阅资料
  • 4.在线投稿
  • 5.免费阅读
  • 6.会员好评
  • 7.原创检测
  • 8.教材赠送
  • 9.联系我们
  • 10.常见问题

即通过对靶序列的特异性扩增,使其产生大量拷贝,以达到检测水平。主要包括以下技术。环介导等温扩增技术,又称为环媒恒温扩增技术或连环恒温扩增技术,是由Notomi等于2000年所开发的一种核酸扩增技术[7]。LAMP的核心是具有链置换活性的Bst(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶的应用以及基于靶核酸6个特异性片段(即5’端的F1、F2和F3区和3’端的B3c、B2c和B1c区,其中F2区和B2区为目的扩增片段)的4条特殊引物的设计,分别为上游内部引物(FIP,由F1c区和F2区组成)、下游内部引物(BIP,由B1c区和B2区组成)、上游外部引物(F3,由F3区组成)及下游外部引物(B3,由B3组成)。整个扩增过程分为起始阶段和循环扩增阶段。⑴起始阶段:FIP的F2序列首先和模板F2c结合,引导合成互补链;随后,F3与模板F3c结合,在BstDNA聚合酶的作用下启动链置换合成并释放出结合有FIP的完整互补链。此单链5’端F1c和F1自我碱基配对形成环状结构。以此链为模版,引物BIP和B3以相同的方式引导另一端链合成、链替换,从而形成哑铃状结构的单链。F1c末端可自发引导补齐中间单链缺口,使哑铃状单链转化为双链茎环结构。此产物可作为下一阶段的起始物为LAMP基因的扩增循环提供模板。⑵循环扩增阶段:引物FIP与茎环结构结合,以双链中一条链为模板延伸,并释放出另一条链,;释出链游离3c端自身成环,引发链延伸取代并释放FIP引导合成的链,两产物均可作为下一循环的起始物。引物BIP和FIP与上述产物的茎环结合重复以上延伸过程,使产物延长同时释放新的链成环并作为新的起始物。其最终产物为一系列长度不同的茎环状双链DNA片段。LAMP灵敏度高、特异性好,且操作简便、快速,结果易于判定,这些优点使得该技术自成立十余年以来在病毒、细菌、寄生虫等各类病原体的基因检测上得到了广泛应用。如:Suzuki、Iwata、Ihira等分别建立了巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、人类疱疹病毒6型(HSV6)的LAMP检测方法[8-10];Iwanoto、Hara-Kudo、Seki等分别针对肺结核分支杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌建立了LAMP检测体系,并对其灵敏度和特异性进行了评价[11-13];而Lin、Han等分别以弓形虫病、四种疟原虫疾病为研究对象,比较了LAMP与real-timePCR、nestedPCR的检测效能,证明LAMP技术可以作为流行区现场快速而简便的疾病筛选工具[14,15]。但因建立时间较短,LAMP仍存在一些不足,其中最大的缺点就是容易出现假阳性。由于LAMP采用了多条引物,而且是在同一温度条件下扩增,引物之间有可能互补而扩增出现非特异性条带。此外,产物鉴定只针对有或无,缺乏一定的特异性。

1989年首先报道的以转录为基础的和核酸扩增技术[16]。该技术从互补的靶核酸(一般为RNA)合成DNA分子开始,以新合成的cDNA为模版进行转录。反应体系主要涉及三种酶活性(T7RNA聚合酶、核糖核酸酶和逆转录酶)和两条特异引物。整个反应过程可分为非循环相和循环相。在非循环相中,以单链RNA为模板,先后在逆转录酶、核糖核酸酶和DNA聚合酶的催化作用下,生成带有T7RNA启动子的双链DNA(cDNA);此双链DNA在T7RNA聚合酶的催化下合成大量互补于靶序列的反义RNA,由此进入循环相。循环相中,以反义RNA为模板,经重复循环的进行cDNA合成、RNA降解、T7RNA聚合酶催化转录,使目的RNA不断得以扩增。TAS主要包括两种反应体系,即依赖核酸序列的扩增(nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA)和转录介导的扩增(transcriptionmediatedamplification,TMA)。前者又称为自主序列复制系统(self-sustainedsequencereplication,3SR),于1990年由Guatelli等首先报道[17];1991年,Compton对此进行了详细描述[18]。该反应体系所涉及的三种酶为:AMVRT(鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶)、RNaseH和T7RNA聚合酶。反映在42℃条件下,1.5h内即可将RNA模版扩增至109~1012倍。相对于NASBA的三酶体系,TMA使用的是二酶体系,即MMRT(money鼠白血病病毒逆转录酶)和R7RNA聚合酶。MMRT兼具有逆转录酶和RNaseH的活性,因此可省略RNaseH,从而降低反映成本,且使体系更稳定。近年来,TMA与实时荧光检测技术相结合,出现了实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT),以直观反映扩增循环情况。TAS非常适用于单链靶RNA的扩增,且不需RT-PCR中的RNA分离过程,从而使RNA病毒的检测变得更加方便。Lau等人利用以NASBA为基础的方法对包括禽流感病毒(AIV)、手足口疾病病毒(FMDV)在内的多种动物病毒进行了检测,证明了NASBA在动物疾病监测中的适用性[19];Mohammadi-Yeganeh等针对HIV-1/HCV建立了实时多重NASBA,并对该方法的分析性灵敏度和特异性以及临床灵敏度和特异性进行了评估,得出结论:该方法可以作为HIV-1/HCV双重感染病人筛查的廉价工具。此外,TAS在支原体、衣原体、细菌、寄生虫等病原体的检测中也得到了应用[20,21]。然而,TAS循环过程较为复杂,须重复加入转录酶和T7RNA聚合酶,因此还有待进一步改善。

SDA是1992年美国学者Walker等首次提出的基于酶促反应的DNA体外扩增技术[22]。反应体系涉及一种限制性内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP及钙、镁离子和缓冲系统。反应过程可分为DNA模版的制备、两端带有酶切位点的目的DNA片段的生成和SDA循环三个阶段。基本原理是:引物与靶DNA序列在3’端杂交,形成两端均为5’悬端的双链。引物链的5’悬端含有限制酶(HincⅡ)的识别位点,外切酶缺陷的DNA聚合酶以dNTP(其中一种为-磷酸硫酸化三磷酸腺苷)为底物延伸3’端。HincⅡ限制性核酸内切酶在半磷酸硫酸化识别位点的未保护链上打开缺口,而修饰的互补链保持完整。切口处DNA聚合酶通过延伸其3’端而替代另一条DNA链;该替代链与引物杂交后又可作为另一反义扩增的靶源,从而实现目标序列的指数增长。SDA的扩增效率高,反应时间短,特异性强,不需要特殊的仪器设备。Walker等采用SDA扩增结核分枝杆菌总DNA中的一段序列,37℃2h后即可将靶序列扩增108倍[23]。然而,SDA所存在的一些缺陷,如需四条特异性引物及经修饰的dNTP作为底物、靶序列准备复杂、产物不均一等,限制了该技术的应用范围。为此,很多研究者在普通SDA的基础上做了近一步改善。如DeanF.B和DetterJ.C等分别利用两组特异引物和一组随机引物建立了两种新的链置换扩增技术,即等温多重链替换扩增(isothermalmulti

HAD是由美国NewEnglandBiolabs的MyriamVincent等模拟动物体内的DNA复制机制所发明的一种新的体外基因扩增技术[26]。其基本原理是:利用解旋酶打开双链DNA;再依靠单链DNA结合蛋白(SSB)与模板结合,使模板处于单链状态并保护其完整性;随后引物与模板杂交,并在DNA聚合酶的催化下扩增;新生成的双链DNA可作为底物进入下一轮的反应。与其他恒温扩增技术相比,HAD操作过程更加简单,且整个过程可在同一温度下进行,可谓是真正的等温扩增。HAD的这一优势表明,该技术在研发现场和作为基层DNA诊断工具方面具有很大潜力。在HAD的基础上,Xu,Y等开发了一种T7复制机器(包括T7解旋酶、外切酶缺陷的T7DNA聚合酶和T7Gp2.5SSB),从而建立了一种新的扩增方式—依赖解旋酶的环形扩增(circularhelicase-dependentamplification,cHDA),利用cHDA可以在同一温度下同时筛选和扩增环形DNA样本,如质粒[27]。Tong等采用新型的恒温荧光定量核酸扩增分析技术(HDA-TaqMan)检测炭疽杆菌与霍乱弧菌等病原菌,提出此技术比传统的PCR扩增技术具有更好的稳定性和特异性,明显改善了PCR技术的假阳性与假阴性的问题[28]。作为一种崭新的恒温核酸扩增方法,HDA目前仅处于初期阶段,从敏感性、准确性和可操作性几方面看,该方法还具有很大的发展空间。受DNA解旋酶的限制,目前主要用于扩增小片段的DNA序列,还有待于寻找更有效的解旋酶以扩大该技术的应用空间。RCA技术是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环式复制方式而建立的一种核酸扩增技术,包括线性扩增和指数扩增两种方式[29]。线性扩增是指将一条引物结合到环状DNA上后,在DNA聚合酶的作用下延伸,产生大量与靶核酸互补的、含重复序列的线状单链DNA。DNA的延伸可不断进行,产生的DNA链在长度上连续分布,因此经凝胶电泳后可见一条宽弥散带。线性RCA用于靶核酸的扩增时,仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体,而且限于200bp以下长度的环。由于其单链扩增性,扩增产物一般可始终连接在固相支持物的引物上,非常适宜于固相形式微阵列局部特异信号的检测。指数RCA技术,又称之为超分支滚环扩增(hyper-branchedrollingcircleamplification,HRCA)或分支扩增(ramificationamplification,RAm)。此技术是在线性RCA的基础上增加一条与环状DNA序列完全一致的引物,该引物与线性RCA产物杂交并酶促延伸,延伸产物可作为第一条引物的模版进行扩增。如此一来,扩增产量在短时间内成指数递增。曹娜娜等将RAM方法与电子芯片有机结合起来,在电子芯片上进行RAM扩增,以大肠埃希菌的O157志贺毒素基因2(shigatoxin2,stx2)作为检测靶基因,确定了该方法的可行性[30]。DeanF.B.等利用φ29DNA聚合酶和一组随机引物,在RCA的基础上建立了一种新的扩增技术,即多重引物滚环复制(multiply-primedrollingcircleamplification),其扩增产物可用于DNA测序、体外克隆、文库建立及其他分子生物学研究,目前该技术在DNA病毒基因组学的研究上已得到了广泛应用[31,32]。

核酸信号放大技术主要用于核酸分子不能直接扩增或核酸分子浓度过低而无法检测的情况。目前主要包括以下技术。2.1分支DNA放大系统(branchedDNAsignalamplificationassay,bDNA)bDNA,即分支DNA,是人工合成的带有多个分支的DNA片段,其每个分支均可作为酶标位点,从而实现信号的放大。bDNA技术由Chrion公司的Hom、Urdea等所构建,其基本原理是:用亲和素包被微孔;加入5’端标记有生物素的第一组探针(捕获探针),该探针不仅可与微孔中的亲和素结合,且与待检靶序列上的某区域互补;然后在微孔中加入待检靶片段,与固定于微孔中的捕获探针结合;再加入第2组探针,该探针一段与靶片段的某一区域互补结合,另一段与bDNA的主链部分序列互补结合;bDNA的每一分枝上都标记碱性磷酸酶;以金刚烷(Dioxetane)作为底物,经碱性磷酸酶作用可发射光子,由荧光分析仪检测化学发光信号报告结果。Flagella等将bDNA技术与以液相芯片荧光微珠为基础的平台相结合,建立了一种高特异性的检测方法—多重分支DNA。该方法不需经过RNA的纯化或目的片段的扩增,直接以细胞裂解物和组织匀浆为标本即可测定多重基因mRNA的表达水平。多重bDNA技术为大规模样本特定基因表达图谱的测定提供了强有力的工具[33]。2.2侵染探针(invader)Invader技术是美国三波技术公司所开发的一种等温DNA和RNA定性和定量检测方法。该技术使用一个耐热的内切核酸酶,根据结构特征在特异位点切割核酸分子。Invader体系包括两个特异性寡核苷酸引物:上游引物和下游引物,又分别称之为侵染探针和信号探针。反应过程中,上游引物全部序列和下游引物3’端均能与靶核酸杂交结合,下游引物带有荧光标记的5’端因不能与靶核酸结合,就如同在上游引物的侵入下而形成的翼状突出。内切核酸酶可识别这种特定结构并将其突出的5’端剪切下来,被剪切的信号探针则与靶核酸分离。随后新的信号探针再次与靶核酸杂交结合,而后被剪切。每个靶核酸每小时能促使释放上千个“翼”,所释放的5’翼在含有荧光共振能量传递的通用报告系统(FRET)中,又可作为第二次入侵的侵染探针,再次形成侵入结构从而被内切酶识别切割,从而进一步达到信号放大的效果。切割下来的5’翼可用荧光板读取器检测,其荧光强度与靶分子量成正比。Invader体系无需核酸扩增即可直接从基因组DNA中检测目的基因。该方法方便、快捷,同时具有较高灵敏度,因此可用于实时监测。此外,因碱基错配可抑制内切酶的识别与剪切,所以该体系也适用于大范围检测基因组单核苷酸多态性(SNPs)[34]。

恒温扩增各技术原理不同,这使得每一项技术在其发展应用过程形成了自己的特色,总结如下。尽管恒温扩增技术各有优缺点,且扩增方式各不行同,所需要本量、样本处理方式等也存在很大差异,但这些特点注定恒温技术将优于非恒温技术(PCR),在分子生物学发展中占有一席之地。而操作简便、过程恒温的本质,使得这些技术在开发便携式基因诊断工具方面具有很大潜力,这将极大促进和改善很多疾病的快速诊断技术和现场筛查现状,从而为人类的健康做出巨大贡献。

本文作者:贾利芳 韩建平 胡薇 工作单位:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

关于本站:中国最大的权威的公务员门户网站-公务员之家创建历经7年多的发展与广大会员的积极参与,现已成为全国会员最多(95.4万名会员)、文章最多、口碑最好的公务员日常网站。荣膺搜狐、新浪等门户网站与权威媒体推荐,荣登最具商业价值网站排行榜第六位,深受广大会员好评。

公务员之家VIP会员俱乐部

在公务员之家您可以分享到最新,最具有时事和代表性的各类文章,帮助你更加方便的学习和了解公文写作技巧,我们愿与您一同锐意进取,不懈的追求卓越。

如何加入公务员之家VIP会员
第一步:先了解公务员之家,查看VIP会员特权
第二步:银行汇款或在线支付,汇款即时到帐
第三步:汇款后立刻联系我们,将您的汇款金额和流水号告诉客服老师,3分钟内系统核查完毕并发送VIP会员帐号到您的手机中,直接登陆即可。

百度推广